Ghi nhận mới và mối quan hệ tiến hóa của epiphyte (Melanothamnus thailandicus) trên rong sụn (Kappaphycus alvarezii) tại Khánh Hòa

của 
Ngân hàng quốc tế Genbank. Trình tự rong phụ 
sinh thu được và các trình tự cùng loài và giống 
có trên Genbank được dóng hàng và so sánh sự 
khác biệt di truyền dựa trên phần mềm Bioedit 
[11].
Mối quan hệ phát sinh loài của epiphyte 
được khảo sát dựa trên trình tự loài rong thu 
được (loài Melanothamnus thailandicus), trình 
tự cùng loài (3 trình tự), 10 trình tự của loài 
cùng giống (trước kia được dịnh danh là giống 
Neosiphonia), và 4 trình tự loài khác giống 
(Polysiphonia spp.) trên Genbank. Thông 
tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số 
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 5
genbank được trình bày ở Bảng 1. Phân tích 
được tiến hành dựa trên thuật toán Neighbour 
Joining (NJ), với giá trị tin cậy (Bootstrap – 
BT) là 1000 sử dụng phần mềm Mega 7.0 [18]. 
Spyridiocolax capixaba và Spyridia clavata 
(Spyridiaceae) được sử dụng làm nhóm ngoại.
Bảng 1. Thông tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số Genbank của các loài epiphyte. Tên loài 
được liệt kê theo Genbank. Tên loài cập nhật được mô tả ở hình 6.
STT Loài
Địa điểm thu 
mẫu
Mã số Genbank Nguồn
1 Melanothamnus thailandicus Việt Nam MT499883 Nghiên cứu hiện tại
2 Neosiphonia thailandica Thái Lan KM502785-87 Muangmai (2014)
3 Neosiphonia yongpilii Hàn Quốc KT964453 Kim và Kim (2016)
4 Neosiphonia yendoi Hàn Quốc KX265484 Kim et al. (2016)
5 Neosiphonia sphaerocarpa Hàn Quốc KX265479 Kim et al. (2016)
6 Neosiphonia japonica Nhật Bản KX265440 Kim et al. (2016)
7 Neosiphonia tongatensis Panama HM573570 Mamoozadeh và Freshwater 
(2012)
8 Neosiphonia harlandii Hàn Quốc DQ787485 Kim và Yang (2006)
9 Neosiphonia decumbens Hàn Quốc DQ787480 Kim và Yang (2006)
10 N.teradomariensis Hàn Quốc KX265441 Kim et al. (2016)
11 Neosiphonia fl avimarina Hàn Quốc KX265439 Kim et al. (2016)
12 Melanothamnus harveyi Úc MF101437 Díaz-Tapia et al. (2017)
13 Polysiphonia pacifi ca Canada MF120858 Savoie và Saunders (2019)
14 Polysiphonia stricta Canada EU492916 Stuercke (2006)
15 Polysiphonia adamsiae Úc MH101825 Díaz-Tapia et al. (2008)
16 Polysiphonia atlantica Tây Ban Nha JX828142 Bárbara et al. (2013)
17 Spyridiocolax capixaba Brazil MH884603 Chen et al. (2019)
18 Spyridia clavata Panama KU756119 Won et al. (2019)
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO 
LUẬN
1. Định loại dựa trên đặc điểm hình thái 
Sau khi quan sát các lát cắt, kết hợp với 
quan sát hình thái từng mẫu epiphyte dưới kính 
hiển vi quang học, đối chiếu với các tài liệu 
về phân loại, nghiên cứu định loại và ghi nhận 
mới 1 loài epiphyte trên rong sụn dựa trên đặc 
điểm hình thái. 
Melanothamnus thailandicus (N. Muangmai 
& C.Kaewsuralikhit) Díaz-Tapia & Maggs, 
2017 
Địa điểm thu mẫu: Vịnh Cam Ranh và Vịnh 
Vân Phong, Khánh Hòa
Vật chủ: Gracilaria fi sher (Thái Lan), 
Kappaphycus alvarezii (Việt Nam, ghi nhận mới)
Dạng Epiphyte (true epiphyte): Đầu tiên, 
epiphyte hình thành các đốm đen li ti, chưa có 
hình dạng rõ ràng, xung quanh các đốm đen có 
dấu hiệu của sự tổn thương cấu trúc mô, sau đó, 
tạo thành các u lồi (Hình 2a), có thể chỉ là các u 
lồi có đỉnh đen, ngay tâm hình thành nên dạng 
sợi, ban đầu chỉ là sợi nhỏ, nhưng dần dần hình 
thành dạng sợi lớn (Hình 2b,c) rồi sau đó có 
khả năng phân nhánh tạo dạng cây (Hình 2d).
Đặc điểm hình thái: Kích thước chiều dài 
từ 0,3 - 2 cm, trung bình 1,5 ±0,05 (n=30) có 
màu nâu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi, thân 
chia thành các đốt theo chiều dọc, phân nhánh 
ở gốc, dạng chữ Y (Hình 3b,c), có 4 tế bào 
quanh tế bào trung tâm ở mỗi đốt (Hình 3b), 
nhánh mang bào tử chỉ có 3 tế bào (Hình 3d). 
Đỉnh sinh trưởng chia thành 3 thùy, 1 thùy lớn 
ở giữa, 2 thùy nhỏ 2 bên (Hình 3a).
6 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020
2. Kiểm chứng định loại epiphyte bằng 
phương pháp sinh học phân tử
2.1. Tách chiết DNA và khuếch đại gen rbcL 
của DNA lục lạp
Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ 
mẫu epiphyte là 1 băng rõ nét nhưng có vệt 
sáng kéo dài (lần rửa giải thứ nhất - E1) do có 
nhiều DNA bị đứt gãy, và 1 băng cho dải sáng 
mờ hơn nhưng không có vệt sáng kéo dài (lầm 
rửa giả thứ hai - E2) (Hình 4). Để đảm bảo chất 
lượng DNA cho phản ứng PCR, nghiên cứu sử 
dụng DNA tách chiết từ mẫu rửa giải E2 để 
khuếch đại đoạn gen rbcL.
Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết làm 
khuôn, cặp mồi F57 và R1381 [10], sản phẩm 
PCR của gen rbcL thu được cho kết quả phù hợp 
với tính toán lý thuyết. Các mẫu đều có băng với 
kích thước tương ứng 1324 bp (Hình 4). 
Hình 3. Hình thái ngoài của M. thailandicus. 
a) Đỉnh sinh trưởng. b) Phân nhánh chữ Y. 
c) Phân nhánh ở gốc. d) Nhánh mang bào tử.
Hình 2. Các dạng của epiphyte dưới kính hiển vi 
soi nổi. a) Dạng u lồi; b và c) Dạng u lồi mọc sợi, 
d) Dạng sợi.
Hình 4: Hình ảnh điện di DNA tổng số và sản phẩm PCR gen rbcL của loài
 Melanothamnus thailandicus
 M: Thang chuẩn DNA 100 bp, E1, E2: DNA tổng số ở lần rửa giải 1 và 2, M1, M2: 
sản phẩm PCR của M. thailandicus, N: mẫu đối chứng âm.
2.2. Kiểm chứng định loại bằng chỉ thị phân tử
Sản phẩm khuếch đại gen rbcL của loài 
M. thailandicus được giải trình tự và dóng 
hàng, thu được trình tự dài 1120 bp. Sử dụng 
tính năng Blast, và so sánh trình tự khác 
biệt, trình tự loài M. thailandicus thể hiện 
sự tương đồng 99,98% (1 sai khác nuceotide 
tại vị trí 683 trên 1120 bp). Sự khác biệt di 
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7
truyền là 0,02 % khi so sánh với các trình tự 
của loài này trên Genbank (Hình 5).
M. thailandicus được mô tả bởi Muangmai 
et al (2014) [15] với tên loài Neosiphonia 
thailandica ở cảng Sri Racha, Vịnh Thái Lan. 
Đặc trưng hình thái cơ bản là các nhánh bào 
tử có 3 tế bào xung quanh. Phân tích mối quan 
hệ phát sinh loài cho thấy M. thailandicus sắp 
xếp chung nhánh với các loài Neosiphonia, và 
gần gũi với loài N. sphaerocarpa và P. forfex. 
Hình 5: Vị trí khác biệt Nucleotide (vị trí 683, in đậm) của trình tự rbcL loài M. thailandicus 
so với các trình tự trên Genbank.
Tên loài 665 675 685 695 705 715
M.thailandica CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAGCG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC
M.thKM502785 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC
M.thKM502787 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC
M.thKM502786 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC
Nghiên cứu hiện tại cho thấy sự tương đồng 
về mặt hình thái (phân nhánh gốc chữ Y, đỉnh 
sinh trưởng có 3 tế bào), và di truyền (tương 
đồng là 99,98% dựa trên chỉ thị rbcL của DNA 
lục lạp) có thể định loại chính xác loài này là 
Melanothamnus thailandicus. Theo Muangmai 
et al (2014) [15], M. thailandicus được tìm 
thấy trên Gracilaria fi sher, vì vậy đây là lần 
đầu tiên loài này được ghi nhận trên rong sụn.
2.3. Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài 
Melanothamnus thailandicus
 Dựa trên trình tự loài M. thailandicus từ 
nghiên cứu hiện tại, và các trình tự có sẵn trên 
Genbank (Bảng 1), phân tích mối quan hệ phát 
sinh loài với giá trị BT trên các nhánh được 
biểu hiện ở Hình 6.
Hình 6: Cây phát sinh loài (phương pháp NJ, phần mềm Mega) của các loài Melanothamnus. Giá trị 
tin cậy (Boostraps) được biểu hiện trên các nhánh. Hình chữ nhật là loài trong nghiên cứu hiện tại. 
Tên mới được cập nhật theo Díaz-tapia et al. (2017) [9]
8 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020
Trên Hình 6, Loài M. thailandicus (tên cũ 
Neosiphonia thailandica) được xếp chung một 
nhánh riêng biệt với các loài này thu từ Thái 
Lan (BT 100%), giúp khẳng định sự định loại 
chính xác và vị trí phân loại của loài. Loài M. 
thailandicus cùng với các loài cùng giống tạo 
thành một nhánh đồng dạng với giá trị BT cao 
(100%). Các loài Melanothamnus spp. thể hiện 
mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc giống 
Polysiphonia. 
Theo Muangmai et al. (2014) [15], N. 
thailandica có quan hệ gần gữi với loài 
N. sphaerocarpa và Polysiphonia forfex. 
Díaz-tapia et al. (2017) [9] đề xuất giống 
Melanothamnus (bao gồm các loài của giống 
Fernandosiphonia và Neosiphonia, và xếp 
3 loài trên vào giống Melanothamnus. Giống 
Melanothamnus (gồm 46 loài) đặc trưng bởi 
đỉnh sinh trưởng có 3 tế bào. Nguồn gốc tiến 
hóa của giống Melanothamnus được ước tính 
là 75,7 - 95,78 triệu năm trước. Mặc dù phát 
sinh trong kỷ Phấn trắng, Melanothamnus 
là một giống chủ yếu ở Ấn Độ - Thái Bình 
Dương, do đó sự vắng mặt của giống này ở 
phía đông bắc Đại Tây Dương hiện vẫn chưa 
thể giải thích [9].
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 
Nghiên cứu ghi nhận mới epiphyte trên 
rong sụn. Dựa trên đặc điểm hình thái và di 
truyền, nghiên cứu định loại chính xác loài 
Melanothamnus thailandicus và khảo sát mối 
quan hệ tiến hóa. Cần có nghiên cứu chuyên 
sâu và trên diện rộng các dạng/loài epiphyte 
trên rong sụn nhằm bổ sung thành phần loài, 
tác nhân gây bệnh góp phần phát hiện sớm và 
có biện pháp phòng, trừ bệnh thích hợp.
LỜI CẢM TẠ: Nhóm tác giả xin gửi lời cảm 
ơn đến Ths. Trương Thị Oanh, và Ths. Trần 
Quang Sáng đã hỗ trợ xử lý hình ảnh và số liệu 
di truyền. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Đình Lâm, Định Thị Ngọc Mai, Nguyễn Lâm Anh, Hoàng Thị Lan, Đinh Thị Thu Hằng, Trần Thị Hồng 
Hà, Lê Mai Hương, Đặng Diễm Hồng (2010), “Đa dạng sinh học của các loài vi sinh vật cơ hội gây bệnh trắng 
nhũn thân (ice – ice disease) trên Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, K. striatum) ở miền trung Việt Nam”. Tạp 
chí Khoa học và Công nghệ. 48, Tr. 311–319.
2. Đinh Thị Hải Yến, (2005) “Thử nghiệm trồng rong sụn (Kappapphycus alvarezii Doty) tại Đàm Bấy, Nha 
Trang, Khánh Hòa”, Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Toàn Quốc về Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật Lần Thứ 
6. Tr. 1828–1833.
3. Huỳnh Quang Năng (2006), “Hoạch định vùng phát triển trồng rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ven biển 
phía Nam Việt Nam”. Báo cáo khoa học, Tr. 25-28.
4. Lê Mai Hương, Trần Mai Đức (2010), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh trong 
phòng bệnh nhũn thân (ice-ice disease) ở rong sụn Việt Nam”, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học chương 
trình CNSH thủy sản.
5. Ngô Thị Thu Thảo, Huỳnh Hàn Châu, Trần Ngọc Hải (2010), “Ảnh hưởng của việc nuôi kết hợp các mật 
độ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) với tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei)”. Tạp chí Khoa học, Trường 
Đại học Cần Thơ 16a, Tr. 100–110. 
6. Nguyễn Hữu Đại (1999), “Rong biển phụ sinh (Epiphyte) trên cỏ biển ở Khánh Hòa”. Tuyển tập Nghiên cứu 
biển IX, Tr. 196–204.
Tiếng Anh
7. Arbeli, Z., Fuentes, C.L., (2007), "Improved purifi cation and PCR amplifi cation of DNA from environmental 
samples". FEMS Microbiology Letters 272, pp. 269–275. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2007.00764.x.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9
8. Borlongan, I.A.G., Luhan, M.R.J., Padilla, P.I.P., Hurtado, A.Q., (2016), "Photosynthetic responses of 
‘Neosiphonia sp . epiphyte-infected’ and healthy Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta) to irradiance, salinity and 
pH variations", Journal of Applied Phycology. 28, pp. 2891–2902 https://doi.org/10.1007/s10811-016-0833-4.
9. Díaz-tapia, P., Mcivor, L., Freshwater, D.W., Verbruggen, H., Wynne, M.J., Maggs, C.A., Gray, V.S.F., 
(2017). "The genera Melanothamnus Bornet & Falkenberg and Vertebrata S . F . Gray constitute well-defi ned 
clades of the red algal tribe Polysiphonieae". European Journal of Phycology 52, 1–30. https://doi.org/10.108
0/09670262.2016.1256436.
10. Freshwater, D.W., Ueness, J., (1994). "Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales, 
Rhodophyta) species, based on rbcL nucleotide sequence analysis". Phycologia 33.
11. Hall, T.A., (1999). "BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for 
Windows95/98/NT". Nucleic Acids Symposium Series. 41, pp. 95–98.
12. Hayashi, L., Anicia., Hurtado, Msuya, F., Bleicher-Lhonneur, G., Critchley, Alan, (2010). "A Review of 
Kappaphycus Farming: Prospects and Constraints, in: Seaweeds and Their Role in Globally Changing Environments". 
Springer Dordrecht Heidelberg, London, pp. 254–283. https://doi.org/10.1007/978-90-481-8569-6.
13. Hurtado, A.., Critchley, A.., (2006). "Seaweed industry of the Phillipines and the problem of epiphytism in 
Kappaphycus farming, in: &, Critchley, Ang, P.O. (Eds.)", Advances in Seaweed Cultivation and Utilisation in 
Asia. University of Malaya, Kuala Lumpur, pp. 21–28.
14. Kearse, M., Moir, R., Wilson, A., Stones-Havas, S., Cheung, M., Sturrock, S., Buxton, S., Cooper, A., 
Markowitz, S., Duran, C., Thierer, T., Ashton, B., Meintjes, P., Drummond, A., (2012). "Geneious Basic: An 
integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data". 
Bioinformatics 28, pp. 1647–1649. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts199
15. Muangmai, N., Yamagishi, Y., Maneekat, S., Kaewsuralikhit, C., (2014). "The new species Neosiphonia 
thailandica sp. nov. (Rhodomelaceae, Rhodophyta) from the Gulf of Thailand". Botanica Marina. 57, pp. 
459–467. https://doi.org/10.1515/bot-2014-0042
16. Nguyen, X., Nguyen, T., Dao, V., Liao, L., (2019). "New record of Grateloupia taiwanensis S . -M . Lin et 
H . -Y . Liang in Vietnam : Evidence of morphological observation and rbc L sequence analysis". Biodiverstas 
20, 688–695. https://doi.org/10.13057/biodiv/d200311
17. Rantetondok, Alexander., Latama, G., (2017). "Epiphytic and Ice-ice Diseases of Seaweed, Kappaphycus 
alvarezii and its Effect on Growth Rate and Carrageenan Qualit". International Journal of Aquaculture 7, pp. 
134–138. https://doi.org/doi: 10.5376/ija.2017.07.0021.
18. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., (2013). "MEGA6: Molecular evolutionary 
genetics analysis version 6.0". Moecular Biology and Evoluion 30, pp. 2725–2729. https://doi.org/10.1093/
molbev/mst197.
19. Trono, C., (1999). "Seaweeds, in: Carpenter, K.E. and Niem, V.H. (Ed.)", The Living Marine Resources of the 
Western Central Pacifi c, Vol. 1. FAO Species Identifi cation Guide for Fishery Purposes. . FAO, Rome, pp. 19–99.
20. Vairappan, C., Chung, CS., Matsunaga, S., (2014). "Effect of epiphyte infection on physical and chemical 
properties of carrageenan produced by Kappaphycus alvarezii Doty (Soliericeae, Gigartinales, Rhodophyta)". 
Journal of Applied Phycolog 26, pp. 923–931. https://doi.org/10.1007/s10811-013-0126-0.
21. Vairappan, C.S., (2006). "Seasonal occurrences of epiphytic algae on the commercially cultivated red alga 
Kappaphycus alvarezii (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)". Journal of Applied Phycolog 18 (3,. pp. 
611–617. https://doi.org/10.1007/s10811-006-9062-6
22. Vairappan, C.S., Chung, C.S., Lhonneur, G.B., Critchley, A., (2007). "Distribution and symptoms of 
epiphyte infection in major carrageenophyte-producing farms". Journal of Applied Phycolog. https://doi.
org/10.1007/s10811-007-9299-8.