Tạo tôm càng xanh toàn đực Macrobrachium rosenbergii nhờ bất hoạt gen Insulin-Like tuyến đực qua công nghệ can thiệp RNA

chuyển 
cái thành công ở các nghiệm thức trong các thí 
nghiệm tiêm tôm.
III. KẾT QUẢ
3.1. Tổng hợp Mr-IAG dsRNA 
3.1.1. Tổng hợp các sợi đơn sense và 
antisense RNA
Sản phẩm các sợi đơn sense và antisense 
RNA đúng kích thước 560 bp và sau đó được 
tinh sạch trước khi cho vào lai ủ để tạo sợi đôi 
dsRNA.
Hình 2. Sợi sense và antisen RNA. Bên trái 
thang DNA là sản phẩm sau khi tinh sạch: 
giếng S là sợi sense, giếng AS là sợi antisense. 
Bên phải thang DNA là sản phẩm trước khi 
tinh sạch:giếng S là sợi sense, giếng AS là sợi 
antisense 
3.1.2. Kiểm tra chất lượng sợi đôi dsRNA
Ở bước này, nghiên cứu kiểm chứng lại 
một lần nữa là trình tự gen đích (dsRNA/Mr-
IAG) có được tổng hợp thành công để chuyển 
thành sợi đôi dsRNA hay không. Các mẫu 
được pha loãng 50 lần để thực hiện bước kiểm 
tra chất lượng. 
7TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 3. Kết quả xử lý các sợi sense, antisense, 
sRNA bằng các loại enzyme, mẫu được pha 
loãng 50 lần
Các giếng bên trái thang DNA là các giếng 
thể hiện phản ứng kiểm tra sợi đơn. Giếng S là 
sợi đơn RNA sense, giếng D là sợi đơn RNA 
sense xử lý với DNase, giếng R là sợi đơn RNA 
sense xử lý với RNase, giếng D + R là sợi sense 
được xử lý với hai loại enzyme DNase và Rnase. 
Bên phải thang DNA là các thử nghiệm 
kiểm tra sợi đôi double – stranded RNA 
(dsRNA). Giếng DS là sợi đôi dsRNA sau khi 
lai hai mạch sense và antisense, giếng D là sợi 
đôi dsRNA được xử lý với DNase, giếng R là 
sợi đôi dsRNA được xử lý với RNase, giếng D + 
R là sợi đôi dsRNA được xử lý với hai enzyme 
DNase và RNase, giếng RIII là sợi đôi dsRNA 
được xử lý với RNase III, giếng C là Positive 
control. Khi xử ký kiểm tra sợi dsRNA thì do 
nó là sợi đôi nên không bị phân giải bởi RNase. 
Tuy nó là sợi đôi nhưng bản chất nó không phải 
là DNA nên cũng không bị phân giải bởi DNase. 
Khi xử lý bằng hỗn hợp hai enzyme DNase và 
RNase thì cũng không bị phân giải. Cho nên tất 
cả các giếng này đều cho băng hình kích thước 
khoảng 560 bp trên agrose 1.5%. Tuy nhiên khi 
được xử lý bằng RNase III - một loại enzyme 
có khả năng phân giải RNA sợi đôi thì trên gel 
điện di không cho băng hình sản phẩm double – 
stranded RNA. Positive control cho kết quả trên 
gel điện di với kích thước khoảng 1000 bp.
Bên trái thang DNA là các thử nghiệm kiểm 
tra sợi đơn single - stranded RNA (ss RNA). Khi 
kiểm tra xử lý sợi single - stranded RNA (sense 
hoặc antisense) với RNase, sợi này sẽ bị phân 
hủy bởi enzyme này nên khi điện di sẽ không 
cho vạch xuất hiện trên gel. Nhưng khi xử lý nó 
với DNase thì nó vẫn không bị phân giải do đó 
có băng hình xuất hiện trên gel với kích thước 
khoảng 560 bp. Khi nó được xử lý với hỗn hợp 
hai enzyme DNase và RNase thì do có sự hiện 
diện của RNase nên kết quả sau điện di cũng 
không cho băng hình nào trên bảng gel.
3.2. Thử nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA 
vào tôm 
Kết quả các thí nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA 
vào tôm post càng xanh toàn đực được thể hiện 
theo 3 độ tuổi tôm post toàn đực khác nhau: 
PL17, PL25 và PL10 được thể hiện ở bảng 2 
và một số hình ảnh tôm thí nghiệm chuyển cái 
được minh họa ở hình 4. Trong thí nghiệm tiêm 
tôm ở tuổi PL17, tổng số lượng tôm tiêm là 36 
con chia đều 3 nghiệm thức tiêm. Số lượng tôm 
chuyển cái còn lại đến tháng thứ 4 sau khi loại 
trừ số tôm hao hụt và tôm chuyển cái không 
thành công là 20 con. Tương tự cho trường hợp 
thí nghiệm tiêm tôm ở tuổi PL25, tổng số lượng 
tôm tiêm là 45 con, số tôm chuyển cái cuối cùng 
là 16 con. Nhìn chung, kết quả tỷ lệ chuyển cái 
thành công ở hai thí nghiệm này có khác biệt 
nhau (tỷ lệ này khoảng 55% ở thí nghiệm tôm 
PL17 và 35% trong thí nghiệm tôm PL25). Tuy 
nhiên khi sử dụng thống kê Fisher exact test 
(two-tailed) so sánh kết quả hai thí nghiệm tiêm 
tôm PL17 và PL25 thấy không khác biệt có ý 
nghĩa (P = 0,1147). 
Khi so sánh kết quả thí nghiệm tiêm tôm 
ở tuổi tôm PL17 và PL10 thì thống kê Fisher 
exact test (two-tailed) cho kết quả tỷ lệ chuyển 
cái thành công ở hai thí nghiệm này là khác biệt 
có ý nghĩa (P = 0,0291). Đồng thời kết quả tỷ 
lệ chuyển cái thành công ở hai thí nghiệm tuổi 
tôm PL25 và PL10 là có sự khác biệt có ý nghĩa 
lớn (P < 0,0001).
Căn cứ trên yếu tố tần suất tiêm thì ở cả hai 
thí nghiệm tôm PL17 và PL25 thì không có sự 
khác biệt có ý nghĩa ở cả 3 nghiệm thức tiêm (P 
> 0,05). Chỉ trong thí nghiệm tiêm tôm ở tuổi 
8 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
PL10 thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê 
giữa nghiệm thức tần suất tiêm 1 tuần/lần và 2 
tuần/lần (P = 0,0355). Như vậy tần suất tiêm có 
ảnh hưởng đến khả năng chuyển cái. 
Bảng 2. Kết quả các thí nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA vào tôm post càng xanh toàn đực
Tuổi 
tôm Thời gian thí nghiệm Đối chứng Tần suất tiêm (tuần/lần) Tổng số
½ tuần 1 tuần 2 tuần
PL17 Ban đầu 10 12 12 12 36
Tháng thứ 1 10 10 10 11
Tháng thứ 2 9 10 9 11
Tháng thứ 3: ngưng tiêm 9 7 6 7 20
Số tôm chuyển cái sau 1 tháng 
ngưng tiêm 0 7 6 7 20
PL25 Ban đầu 13 15 15 15 45
Tháng thứ 1 13 15 10 15
Tháng thứ 2 10 13 7 15
Tháng thứ 3: ngưng tiêm 10 7 4 10 21
Số tôm chuyển cái sau 1 tháng 
ngưng tiêm 0 7 1 8 16
PL10 Ban đầu 100 100 100 200
Tháng thứ 2,5: ngưng tiêm 67 81 148
Số tôm chuyển cái sau 1 tháng 
ngưng tiêm 0 67 81 148
Hình 4. Tôm chuyển cái 
thành công. A: quan sát nhú 
lồi ở vị trí chân bò số 5. B: 
quan sát gai sinh dục đực 
ở chân bơi số 2 dưới kính 
hiển vi. Tôm chuyển cái 
không thành công C: nhú 
lồi ở vị trí chân bò số 5. D: 
gai sinh dục đực ở chân bơi 
số 2. E: chân bơi số 2 của 
tôm chuyển cái có dấu hiệu 
bất thường. 
9TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN
Sản phẩm sợi đôi dsRNA Mr-IAG cho 
kết quả ở kích thước khoảng 550bp và trình tự 
tương đồng cao (99%: phân tích giải trình tự từ 
kết quả trước của đề tài) với trình tự công bố của 
tác giả Ventura (2009). Đồng thời qua việc kiểm 
tra chất lượng dsRNA Mr-IAG ( kiểm tra, xử lý 
bằng 3 loại enzyme đặc thù) cho thấy sản phẩm 
sợi đôi dsRNA Mr-IAG tổng hợp được là RNA 
mạch đôi và đứng trình tự công bố và sẵng sàng 
cho việc thử nghiệm tiêm sợi dsRNA vào tôm. 
Kết quả tiêm tôm cho thấy, trong cả ba 
thí nghiệm trên 3 độ tuổi tôm post toàn đực 
khác nhau: PL17, PL25 và PL10 thì đều cho 
kết quả chuyển cái. Tuy nhiên ở độ tuổi càng 
lớn PL25 thì hiệu quả chuyển cái thấp (ở đây 
không báo cáo số liệu chi tiết về số tôm không 
chuyển cái là do tôm bị hao hụt và một phần 
do tôm đã chuyển cái nhưng bị quay trở lại giới 
tính ban đầu là tôm đực – ‘lại đực’). Tuy nhiên 
trong quá trình thí nghiệm, tôm lớn PL25, rất 
dễ tiêm, tỷ lệ sống cao, ít hao hụt nhưng tôm 
ở tuổi này đã có dấu hiệu biệt hoá giới tính 
nên khả năng ức chế hoạt động phát triển của 
hormone sinh dục đực của sợi dsRNA là không 
đạt hiệu quả cao. Ngược lại, tôm nhỏ PL10, khi 
tiêm thì chỉ có số liệu tôm do hao hụt còn tỷ lệ 
‘lại đực’ gần như không có. Trong thí nghiệm 
tiêm tôm PL10, sự khác biệt có ý nghĩa giữa 
hai tần suất tiêm chủ yếu là do khi giảm tần 
suất tiêm sẽ giảm tỷ lệ hao hụt vì tiêm nhiều 
lần, tôm yếu và dễ chết dẫn đến tỷ lệ tôm còn 
lại chuyển cái thành công thấp.
V. KẾT LUẬN
Chất lượng sợi đôi dsRNA có hiệu quả 
chuyển đổi giới tính cho tôm càng xanh hậu ấu 
trùng đực.
Tuổi tôm ảnh hưởng rất lớn đến sự chuyển 
cái của tôm thí nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA, 
tuổi tôm càng nhỏ thì hiệu quả chuyển cái càng 
cao và tỷ lệ tôm lại đực sẽ không xảy ra. Tần 
suất tiêm không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ tôm 
chuyển cái thành công, nhưng tần suất tiêm 
càng dày thì tôm phát triển kém hoặc tăng tỷ lệ 
chết do tôm yếu khi tiêm nhiều lần.
LỜI CÁM ƠN
Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám 
ơn đến Vụ KHCN&MT, Ban lãnh đạo Viện 
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Trung tâm 
Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ 
và các thành viên đề tài đã tận tình định hướng 
kịp thời, đóng góp ý kiến chiến lược để đề tài có 
kết quả thành công.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aigner A., 2007. Nonviral in vivo delivery of therapeu-
tic small interfering RNAs. Curr. Opin. Mol. Ther. 
9, pp 345–352.
Davis M.E., Zuckerman, Chung Hang J., Choi, David 
Seligson, Anthony Tolcher, Christopher A., Alabi, 
Yun Yen, Jeremy D., Heidel & Antoni Ribas, 2010. 
Evidence of IRNA in humans from systemically 
administered siRNA via targeted nanoparticles. 
Nature. 2010 Apr 15; 464(7291):1067–70. Epub 
2010 Mar 21.
Fingerman M., 1997. Role of neurotransmitters in 
regulating reproductive hormon release and 
gonadal maturation in decapods crustaceans, 
Invertebrate Reproduction and Development 31, 
pp 47– 74. 
Galvani A., and Sperling L., 2002. RNA interference by 
feeding in Paramecium. Trends Genet 18, 11–12.
Guan, Haoji, 2006. Double–stranded RNA induced 
gene silencing of neuropeptide genes in sand 
shrimp, Metapenaeus ensis and development 
of crustacean primary cell culture. Hong Kong 
University.
Nagamine C., Knight W., Maggeneti A., and Paxman, G., 
1980. Masculinization of female Macrobrachium 
rosenbergii (de Man) (Decapoda, Palaemonidae) 
by androgeneic gland implantation, General and 
comparative endrocrinology 31(4), 442–457.
10 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Ongvarrasopone C., Roshorm Y., and Panyim S., 2007. 
A Simple and Cost Effective Method to Generate 
dsRNA for IRNA Studies in Invertebrates. Science 
Asia 33, 35–39.
Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E., Hannon 
G.J., Conklin D.S., 2002. Short hairpin RNAs 
(shRNAs) induce sequence–specific silencing in 
mammalian cells. Genes Dev. 16, 948–958.
Peng Y., Lu J.X., Shen X.F., 2007. shRNA driven by 
Pol II/T7 dual–promoter system effectively induce 
cell–specific RNA interference in mammalian 
cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 
496–500.
Plasterk, 2002. RNA silencing: the geneome’s immune 
system. Science 17 May 2002: Vol. 296 no. 5571 
pp. 1263–1265.
Sachiko Suzuki, 1999. Androgeneic gland hormon 
is a sex–reversing factor but cannot be a sex–
determining factor in the female Crustacean 
Isopods Armadillidium vulgare. General and 
comparartive endrocrinology 115(3), 370–378.
Sagi A., and Afalo E.D., 2005. The androgeneic 
gland and monosex culture of freshwater prawn 
Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a 
biotechnological perspective. Aquaculture 
Research 36, 231–237.
Sagi Amir, Cohen Dan, Milner Yoram, 1989. Effect 
of androgene gland ablation on morphotypic 
differentiation and sexual characteristics of male 
Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, 
General and comparative endocrinology 77, 
15 – 22.
Sagi A., Milstein A., Eran Y., Joseph D., Khaila I., 
Abdu U., Harpaz S., and Karplis I., 1997. Culture 
of the Australian redclaw crayfish (Cherax 
quadricarinatus) in Israel, II. Second growout 
season of overwintered populations. Israelli 
Journal of Aquaculture–Bamidgeh 59, 222–229.
Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G., and Karplus 
I., 1996. Intersex red claw crayfish, Cherax 
quadricarinatu (Von martens): functional males 
with pre–viellogeneic ovaries. Biol.Bull 190, 
16–23.
Sagi Amir, Snir Eviatar and Khalaila Isam, 1995. Sexual 
differentiation in decapods crustaceans: role of the 
androgeneic gland. Invertenrate Reproduction an 
Development 31 (1–3), 55 – 61.
Sagi A., and Ra`ana Z., 1988. Morphotypic 
differentiation of males of freshwater prawn 
Macrobrachium rosengergii: changes in the 
midgut glands and the reproductive system. 
Journal of crustacean biology 8, 43–47.
Sanders B., 1983. Insulin–like peptides in the lobster 
Homarus americanus.I. insulin immunoreactivity. 
General and Comparative Endocrinology 50, 
366–373.
Spence R. Malecha, Patricia, Nevin A., Phyllis Ha, 
Loena E. Barck, Yara Lamadrid–Rose, Scott 
Masuno and Dennis Hedgecock, 1992. Sex–
ratios and sex–determination in progeney from 
crosses of surgically sex–reversed freshwater 
prawns, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 
105(3–4), pp 201–218.
Tabara H., Grishok, A., Mello, C., 1998. IRNA in 
C.elegans: Soaking in the Geneome Sequence. 
Science 16 October 1998: Vol. 282 no. 5388, pp. 
430–431.
The Nobel Prize in Physiology ỏ Medicin, 2006. RNA 
interference, pp 1–10.
T., Ramos L., Huberman A., 2007. Effect of RNA 
interference on gene functions of aquatic 
organisms. Biotecnologia Aplicada Vol. 24, No. 2.
Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S., 
Glazer L., and Sagi A., 2009. Temporal silencing 
of an androgeneic gland–specific insulin–like 
gene affecting phenotypical geneder differences 
and spermatogenesis. Department of Life. General 
Endocrinology 150, 1278–1286.
Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., and Bartel D.P., 
2000. IRNA: Double–stranded RNA directs the 
ATP–dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 
nucleotide intervals. Cell. 101, 25–33.
11TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ALL MALE REPRODUCTION OF Macrobrachium rosenbergii BY INSULIN-
LIKE GENE SILENCING IN THE ANDROGENIC GLAND THROUGH RNA 
INTERFERENCE
Bui Thi Lien Ha1, Nguyen Duc Minh1, Le Thi Hoai Oanh1, Tran Thanh Vo1, Nguyen Dien1, 
Le Chinh1, Nguyen Viet Dung2, Nguyen Van Hao3
ABSTRACT 
Within the aquaculture industry in Vietnam, the demand of the all male prawn Macrobrachium 
rosenbergii seed is one of overriding importance. Macrobrachium rosenbergii is an important 
freshwater prawn species having commercial importance in Vietnam. The all male prawn farming 
brings most highly profitable for farmers; therefore seed demand for popular culture is always 
very high. Lasted technology called RNA interference for creating neo-female is inactivated a 
single IAG-encoding gene of male insulin-like prawn (Macrobrachium rosenbergii insulin-like 
androgeneic gland, Mr-IAG) for producing all male seed is being successfully implemented at the 
Research Institute for Aquaculture No. 2. The currently result has achieved with double-stranded 
RNA (dsRNA) synthesis to mRNA encodes Androgenic Gland. The important factor for success is 
very young shrimp age at the time of the first injection, period and time of injections. Sex reversal 
rate after two to three months injection is 88-92% female, dsRNA of injection time around 2 months; 
frequency of dsRNA injection is 2 weeks.
Keywords: fresh water prawn, sex-reversal, iRNA.
Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền
Ngày nhận bài: 10/02/2014
Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014
Ngày duyệt đăng: 01/4/2014
1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. 
 Email: lienha09@gmail.com 
2 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 2. 
3 Research Institute for Aquaculture No 2.