Ảnh hưởng của các liều Heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú

ssie Biosafe; M = thang protein) (hình trái). DnaK được xác định 
sau khi thực hiện phản ứng Western Blot (hình phải)
Hình 6. Máu tôm được thu và chứa trong dung 
dịch kháng đông, giữ lạnh
Hình 7. Phản ứng PO assay được thực hiện 
trong cuvet
31TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Ở thời điểm 2 giờ sau khi tiêm DnaK có 
sự tăng nhẹ của phenoloxidase ở nghiệm thức 
tiêm 8, 10 và 15µg protein, các liều tiêm còn 
lại có phenoloxidase tăng rất ít và không khác 
nhiều so với đối chứng (Đồ thị 1). Khuynh 
hướng này cũng được ghi nhận ở lần thí 
nghiệm thứ 2 (Đồ thị 2). Ở các thời điểm 7 và 
10 giờ sau khi tiêm DnaK, hầu hết các nghiệm 
thức tiêm DnaK có biến động phenoloxidase 
gần bằng với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm 
thức tiêm 10µg DnaK có phenoloxidase tăng ở 
cả 2 thời điểm thu mẫu 2 và 4 giờ. Tuy nhiên, 
việc tăng giảm phenoloxidase ở các nghiệm 
thức chưa có sự khác biệt rõ rệt. Chính vì vậy, 
phản ứng định lượng bằng realtime PCR cần 
được thực hiện để xem biến động về mặt định 
lượng ở các nghiệm thức theo các thời gian 
thu mẫu khác nhau như thế nào (Kết quả được 
trình bày ở phần sau).
Đồ thị 1. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm 
(thí nghiệm 1)
Đồ thị 2. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm 
(thí nghiệm 2)
32 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.2.2. Kết quả định lượng phenoloxidase 
bằng RT-PCR trên máu tôm thu sau khi tiêm 
với các liều khác nhau của DnaK
Kết quả ở Đồ thị 3 cho thấy ở thời điểm 2 
giờ sau khi tiêm DnaK có sự gia tăng đáng kể 
(gấp 4 lần so với đối chứng) của PO ở nghiệm 
thức tiêm 8 và 10 µg DnaK. Sự khác biệt này 
còn được tìm thấy ở thời điểm 4 giờ. Tuy nhiên 
ở các thời điểm 7 và 10 giờ không tìm thấy sự 
khác biệt về tỷ lệ biểu hiện mRNA ProPO ở các 
nghiệm thức. Ở lần thí nghiệm thứ hai cũng cho 
khuynh hướng tương tự (Đồ thị 4)
Đồ thị 3. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của 
DnaK (thí nghiệm 1)
Đồ thị 4. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của 
DnaK (thí nghiệm 2)
33TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN
Hsp70 là một loại protein được nhận định là 
thường hiện hữu trong hầu hết các loại tế bào, 
tăng mạnh khi đáp ứng với các điều kiện stress 
hay yếu tố lạ và tôm sú cũng không phải là điều 
ngoại lệ. Ở liều tiêm 8 và 10 μg DnaK đã kích 
thích biểu hiện PO cao gấp 4 lần ở thời điểm 
2 giờ sau khi tiêm. Lượng PO vẫn còn cao ở 
nghiệm thức này tại thời điểm 4 giờ nhưng sau 
đó giảm đáng kể ở các thời điểm thu mẫu còn 
lại. Có thể là do bản chất DnaK hay đáp ứng 
miễn dịch của tôm chỉ biểu hiện và kéo dài trong 
một khoảng thời gian ngắn. Ở các thời điểm sau 
4 giờ có thể là do sự bình ổn của hệ miễn dịch 
nên không thấy tăng giảm PO đáng kể.
Đã có rất nhiều nghiên cứu cho rằng HSP70 
đóng vai trò như yếu tố hoạt hóa hệ miễn dịch 
tự nhiên (Pockley, 2003; Tsan, 2004) cụ thể là 
kích thích hoạt động của các tế bào trong hệ 
miễn dịch. Nghiên cứu đầu tiên về ứng dụng 
HSP70 tái tổ hợp cho thấy HSP70 có khả năng 
kích thích sự sản sinh cytokines như IL-1 hay 
TNF-α từ bạch cầu đơn nhân lớn ở người hay 
đại thực bào ở chuột trong điều kiện in vitro 
(Basu và ctv., 2002; Galdiero và ctv., 1997). 
Prophenoloxidase đóng vai trò quan trọng trong 
đáp ứng miễn dịch ở giáp xác. Các nghiên cứu 
cho thấy ProPO có vai trò quan trọng trong cơ 
chế miễn dịch chống lại các bệnh nhiễm khuẩn 
hay ký sinh trùng (Cerenius và Söderhäll, 2004).
Hiện tại chưa thấy công bố nghiên cứu về 
ảnh hưởng của tiêm Hsp70 lên PO trên tôm sú. 
Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp của Hsp70 và vi 
khuẩn Vibrio campbellii lên PO trên Artemia 
đã được Baruah và ctv., (2011) nghiên cứu. 
Theo nhóm tác giả này khi cho Artemia nuôi 
trong điều kiện vô trùng ăn Hsp70 từ Artemia 
hoặc Hsp70 được kích thích sinh ra từ E. coli 
tiếp theo đó là gây nhiễm bằng V. campbellii cho 
thấy tăng cường hệ thống ProPO được chứng 
minh bằng mRNA và ở mức độ protein. Nghiên 
cứu này cho thấy rằng Hsp70 có nguồn gốc từ 
prokaryotic hay eukaryotic đều là nguồn khơi 
dậy tác dụng bảo hộ miễn dịch ở Artemia chống 
lại tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ 
thống ProPO. Đây là một trong những nghiên 
cứu đầu tiên về hoạt động hoạt hóa của Hsp70 ở 
động vật không xương sống.
Theo Ryckaert và ctv., (2010) thì Hsp70 
tái tổ hợp khi tiêm vào playfish (Xiphophorus 
maculates) có vai trò kích thích miễn dịch 
kháng lại tác nhân gây bệnh Yersinia ruckeri. 
Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ vẫn chưa so sánh 
được với vaccine.
Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức 
tiêm Hsp70 liều 2, 4, 6 µg DnaK hầu như không 
có sự khác biệt lớn về phenoloxidase so với 
nhóm đối chứng ở các thời điểm thu mẫu. Theo 
các nghiên cứu trước đây thì lượng PO sinh ra 
có liên quan đến chu kỳ lột xác của tôm. Liu và 
ctv., (2004) nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng 
8,0–14,4 g ở các giai đoạn lột xác khác nhau 
cho thấy tổng số tế bào máu cao nhất ở giai 
đoạn sau lột xác lớp vỏ đã cứng (intermoult) 
nhưng thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột xác. 
Hoạt động phenoloxidase cao nhất ở giai đoạn 
intermoult và thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột 
xác. Hoạt động thực bào của tôm với Vibrio 
alginolyticus giảm một cách đáng kể ở giai 
đoạn vừa sau lột xác và giai đoạn tiền lột xác. 
Trong một thí nghiệm khác, khi tiêm tôm thẻ 
chân trắng ở các giai đoạn lột xác khác nhau 
với 105 CFU V. alginolyticus cho thấy sau 10 
giờ tiêm cho thấy tỷ lệ chết ở nhóm vừa sau 
lột xác cao hơn và có ý nghĩa so với nhóm ở 
giai đoạn intermoult. Sau 48-120 giờ theo dõi 
cho thấy nhóm tôm ở giai đoạn vừa sau lột 
xác có tỷ lệ chết cao nhất và nhóm intermoult 
cho tỷ lệ chết thấp nhất. Vì vậy để loại trừ khả 
năng ảnh hưởng của các giai đoạn lột xác đến 
phenoloxidase sau khi tiêm với các liều khác 
nhau của DnaK, trong nghiên cứu này chúng 
34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
tôi đã chọn lựa tôm đồng đều về giai đoạn lột 
xác trước khi tiến hành thí nghiệm. 
Theo Sung (2014) khi cho ấu trùng tôm thẻ 
chân trắng ăn E. coli YS 2 có khả năng sản sinh 
DnaK khi kích thích bằng Arabinose làm tăng 
cường khả năng đề kháng khi gây nhiễm với 
V. harveyi. Bằng phương pháp Realtime PCR 
nhóm tác giả này tìm thấy ở nhóm cho ăn E. coli 
tăng crustin mRNA gấp 7 lần so với nhóm đối 
chứng. Tuy nhiên nhóm tác giả này không tìm 
thấy sự khác biệt so với nhóm đối chứng về các 
chỉ tiêu miễn dịch khác như ProPO, penaeidin, 
hemocyanin và peroxinectin.
Theo kết quả nghiên cứu của Hu và ctv., 
(2014) cho thấy DnaK có khả năng kích thích 
hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng. 
Sau khi tiêm tôm thẻ chân trắng với DnaK 
tinh sạch liều 5 µg/tôm nhóm tác giả này tìm 
thấy có sự tăng có ý nghĩa thống kê đối với chỉ 
tiêu transglutaminases và prophenoloxidases ở 
tôm thẻ chân trắng tại thời điểm 3 giờ sau khi 
tiêm DnaK. Ngoài sự tăng PO còn có sự tăng 
giảm của các gen liên quan đến miễn dịch 
trên tôm thẻ chân trắng như Penaeidin (PEN), 
Transgluminase (TGase-1), endogenous HSP70 
(lvHSP70) (lv = left ventricular). Tuy nhiên, 
không phải tất cả các gen điều hòa miễn dịch 
đều tăng sau khi tiêm DnaK và chỉ giới hạn ở 
một số và ở các điểm thời gian nhất định.
V. KẾT LUẬN
Tiêm tôm với 8, 10 µg DnaK làm tăng biểu 
hiện của proPO tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi 
tiêm, điều này được xác định bằng phản ứng 
định lượng RT-PCR.
Kết quả kiểm tra hoạt tính của phenoloxidase 
bằng phản ứng Phenoloxidase được thực hiện 
trên cuvet chưa thấy sự khác biệt lớn về hoạt tính 
phenoloxidase khi tiêm tôm với DnaK. Tuy nhiên 
với kết quả định lượng cho thấy sự khác biệt có ý 
nghĩa thống kê ở một số thời điểm thu mẫu.
LỜI CÁM ƠN 
Nghiên cứu này được thực hiện trong nội 
dung chương trình nghiên cứu song phương 
Việt Bỉ với kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa 
học và Công nghệ Quốc gia. Nhóm tác giả 
chân thành cảm ơn sự tài trợ của Quỹ cũng như 
sự giúp đỡ của các giáo sư thuộc Laboratory 
of Aquaculture & Artemia Reference Center 
(Gent, Belgium).
35TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Basu, N., Todgham, A.E., Ackerman, P.A., Bibeau, 
M.R., Nakano, K., Schulte, P.M., Iwama, G.K., 
2002. Heat shock protein genes and their functional 
significance in fish. Gene 295: 173–183.
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P., 
2010. Efficacy of heterologous and homologous 
heat shock protein 70s as protective agents to 
Artemia franciscana challenged with Vibrio 
campbellii. Fish & Shellfish Immunology 29: 
733-739
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., Macrae, T.H. and 
Bossier, P., 2011. Primming the prophenoloxidase 
system of Artemia Franciscana by heat shock 
proteins protects against Vibrio campbellii 
challenge. Fish & Shellfish Immunology 
31(1):134-41
Cerenius, L., Soderhall, K., 2004. The prophenoloxidase-
activating system in invertebrates. Immunology 
Review 198: 116–126.
Galdiero, M., de l’Ero, G.C., Marcatili, A., 1997. 
Cytokine and adhesion molecule expression in 
human monocytes and endothelial cells stimulated 
with bacterial heat shock proteins. Infecion and 
Immunity 65 (2): 699-707
Hu, B., Phuoc, L.H., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2014. 
Bacterial HSP70 (DnaK) is an efficient immune 
stimulator in Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 
418–419, 87–93.
Ji, P-F., Yao, C-L., Wang, Z-Y., 2009. Immune response 
and gene expression in shrimp (Litopenaeus 
vannamei) hemocytes and hepatopancreas against 
some pathogen-associated molecular patterns. 
Fish & Shellfish Immunology 27: 563-570
Lindquist, S., and Craig, E. A., 1988. The heat shock 
proteins. Annual Review Genetic 22: 631-637.
Liu, C-H., Yeh, S-T., Cheng, S-Y., and Chen, J-C., 
2004. The immune response of the white shrimp 
Litopenaeus vannamei and its susceptibility to 
Vibrio infection in relation with the moult cycle. 
Fish & Shellfish Immunology 16: 151–161
Liu, C.H., Yeh, S.P., Kuo, C.M., Cheng, W., Chou, 
C.H., 2006. The effect of sodium alginate on 
the immune response of tiger shrimp via dietary 
administration: activity and gene transcription. 
Fish & Shellfish Immunology 21:442-253.
Pockley, A. G., 2003. Heat shock proteins as regulators 
of the immune response. The Lancet 362: 469-
476. 
Pockley, A.G., 2005. Heat shock proteins as regulators 
of the immune response. The Lancet 362: 469–476.
Ryckaert, J., Pasmans, F., Tobback, E., Duchateau, L., 
Decostere, A., Haesebrouck, F., 2010. Heat shock 
proteins protect platyfish (Xiphophorus maculatus) 
from Yersinia ruckeri induced mortality. Fish & 
Shellfish Immunology 28: 228–231.
Sergio, H. M., Pablo, C., Marcela, Z., Jorge, O., 
Fernando, G., Patricio, C., and Vitalia, H., 2007. 
Immunological characterization of a bacterial 
protein isolated from salmonid fish naturally 
infected with Piscirickettsia salmonis. Vaccine 
25: 2095–2102.
Singh, V., and Aballay, A., 2006. Heat-shock 
transcription factor (HSF)-1 pathway required for 
Caenorhabditis elegans immunity. Proceedings 
of the National Academy of Sciences USA 103: 
13092-13097.
Sritunyalucksana, K., sithisarn, P., withayachumnarnkul, 
B., and flegel, T.W., 1999. Activation of 
prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial 
activity in haemolymph of the black tiger prawn, 
Penaeus monodon, by immunostimulants. Fish & 
Shellfish Immunology 9: 21–30.
Sung, H.H., Chang, H.J., Her, C.H., Chang, J.C., 
Song, Y.L., 1998. Phenoloxidase activity of 
hemocytes derived from Penaeus monodon 
and Macrobrachium rosenbergii. Journal of 
Invertebrate Pathology 71(1): 26-33.
Sung, Y.Y., 2014. Heat Shock Proteins: An Alternative 
to Control Disease in Aquatic Organism. Journal 
of Marine Science: Research & Development 
4:e126. doi: 10.4172/2155-9910.1000e126.
Tsan, M.F., 2004. Cytokine function of heat-shock 
proteins. AJP: Cell Physiology, 286, 739-744.
Yeong, Y.S., Van Damme, E. J.M., Sorgeloos, P., and 
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect 
gnotobiotic Artemia franciscana larvae against 
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology 
22: 318-326.
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos, 
P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic 
Artemia franciscana larvae to abiotic stress 
promotes heat shock protein 70 synthesis 
and enhances resistance to pathogenic Vibrio 
campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66.
Yeong, Y.S, Ashame, M.S., Chen, S., MacRae, T.H., 
Sorgeloos, P. and Bossier, P., 2009. Feeding 
Artemia franciscana (Kellogg) larvae with 
bacterial heat shock protein, protects from Vibrio 
campbellii infection. Journal of Fish Diseases 32 
(8): 675-685.
36 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
EFFECT OF DIFFERENT DOSE OF HEAT SHOCK PROTEINS ON IMMUNE 
PARAMETERS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)
Le Hong Phuoc1*, Nguyen Hong Loc1, Nguyen Thi Hien1, Vo Hong Phuong1
ABSTRACT
This study was conducted to evaluate the effect of different doses of bacterial heat shock protein 
(DnaK) on immune response of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Shrimp’s immune 
response was tested by carrying out phenoloxidase reaction in cuvet, then measuring OD492nm 
by photospectrometer and quantification of mRNA by Real-time PCR. DnaK was extracted from 
E. coli strain overexpressing DnaK with a hexahistidine-tag. After extraction DnaK was purified 
by Dynabead manegtic beads. The concentration of purified recombinant DnaK was determined 
by Bradford assay. DnaK sample was then combined with loading buffer and electrophoresed in 
10% SDS-PAGE gels. Gels were either stained with Bio-safe Coomassie stain (SDS-PAGE) or 
transferred to polyvinylidene fluoride membranes for antibody probing (Western Blot). The juvenile 
P. monodon shrimp (mean body weight = 10-12g) were injected with DnaK at a dose of 2, 4, 6, 8, 10 
or 15 µg shrimp-1. Haemolymph were collected at 2, 4, 7, and 10 hours post DnaK injection. The 
expression of prophenoloxidases gene was monitored via quantitative RT-PCR. Shrimps injected 
with 8 or 10 µg DnaK resulted in significantly increase in PO at 2 and 4 hours post injection 
compared to other treatments (p < 0.05). This result suggests that DnaK is able to modulate immune 
responses in P. monodon.
Keywords: DnaK, shrimp, prophenoloxidase, HSP
70.
Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015
1. Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2. 
* Email: lehongphuoc@yahoo.com