Tần số xuất hiện vibrio cholerae trên tôm và nhuyễn thể, xác định serogroup O1, O139 và biotype của V. Cholerae bằng kỹ thuật Multiplex-PCR

ng tính với V. cholerae ở m-PCR 1 
Phản ứng m-PCR2 được thực hiện với DNA ly trích từ hai nguồn gốc khác nhau: 
216 mẫu DNA (106 mẫu ở môi trường 1 và 110 mẫu ở môi trường 2) được ly trích từ 
dung dịch tăng sinh của các mẫu dương tính với V. cholerae ở m-PCR1 để xác định sự 
hiện diện của gen độc lực ctxA, gen rfbO1 và rfbO139 và 375 mẫu DNA được ly trích 
từ 375 gốc V. cholerae đã được định danh bằng thử nghiệm sinh hóa và khẳng định lại 
bằng m-PCR1 để xác định sự hiện diện của serogroup O1 và O139 trong các gốc định 
danh được (phân lập từ môi trường TCBS và thử sinh hóa). 
sodB 
V.16S 
 1 2 3 4 5 6 7 8 L 9 10 11 
Chú thích 1: V. parahaemolyticus; 2:E. coli; 3: S. aureus; 4: L. seeligeri; 5: P. aeruginosa; 
6: A.hydrophila; 7: S. typhimurium; 8: Shigella sonei; L:Thang chuẩn 100 bp; 9: V.cholerae O1; 10: V. 
cholerae O139; 11: V.cholerae O1+ O139. 
248 
663 
663 
Chú thích:1 – 5: 5 mẫu môi trường 2; L: Thang chuẩn 100 bp; 6: Đối chứng dương; 
7 và 8: mẫu khảo sát môi trường 1 
 1 2 3 4 5 L 6 7 8 
451 451 451 451 
tcpA El Tor 
Chú thích: 1 – 4: 4 mẫu môi trường 2; 5: Đối chứng âm; L: Thang 
chuẩn 100bp; 6: Đối chứng dương; 7,8: 2 mẫu môi trường 1 
Chú thích:1:V. parahaemolyticus; 2:E. coli; 3: S. aureus; 4: L. seeligeri; 5: P. aeruginosa; 
6: A.hydrophila; 7: S. typhimurium; 8: Shigella sonei; L:Thang chuẩn 100 bp; 9: V.cholerae O1+ 
O139; 10: V. cholerae O139;11: V. cholerae O1 
302 
rfBO1 
449 
192 
ctxA 
rfBO139 
 1 2 3 4 5 6 7 8 L 9 10 11 
Chú thích: 1:V. parahaemolyticus; 2: E. coli; 3: S. aureus; 4: L. seeligeri; 5: P. 
aeruginosa; 6: A.hydrophila; 7: S. Typhimurium; 8: Shigella sonei; L:Thang 
chuẩn 100 bp; 9: V.cholerae O1+ O139; 10: V. cholerae O139; 11: V. cholerae O1 
Chú thích 1: V. parahaemolyticus; 2: E. coli; 3: S. aureus; 4: L. seeligeri; 5: P. 
aeruginosa; 6: A.hydrophila; 7: S. Typhimurium; 8: Shigella sonei; L:Thang chuẩn 
100 bp; 9: V.cholerae O1; 10: V. cholerae O139; 11: V.cholerae O1+ O139 
 53 
Bảng 2. So sánh tỷ lệ phát hiện V. cholerae giữa phương pháp sinh hóa và m-PCR 
DNA ly trích từ dung dịch tăng sinh 
Các gen đích 
Môi trường 1 
(n = 106) 
Môi trường 2 
 (n = 110) 
n % n % 
ctxA + rfbO1+ rfbO139 0 0,0 2 1,8 
ctxA + rfbO1 2 1,9 2 1,8 
ctxA + rfbO139 8 7,5 11 10,0 
rfbO1 2 1,9 4 3,6 
rfbO139 2 1,9 4 3,6 
ctxA 13 12,3 18 16,4 
Tổng số mẫu dương tính 27a 26,4 41b 37,3 
Ghi chú: a, b: khác biệt có ý nghĩa thống kê 
Kết quả Bảng 3 cho thấy phương pháp tăng sinh bằng môi trường 2 giúp m-PCR2 
phát hiện các gen mục tiêu cao hơn môi trường 1 (41 mẫu so với 27 mẫu) và khả năng 
phát hiện đồng thời 2-3 gen cũng cao hơn môi trường 1 (15 mẫu so với 10 mẫu). Ngoài 
ra, khi dùng môi trường 2 tăng sinh còn giúp m-PCR2 phát hiện 2 mẫu dương tính đồng 
Dung dịch pepton muối kiềm (Môi trường 1) 
Địa điểm 
 Phương 
 pháp 
 Loại mẫu 
Đồng Nai (n = 127) 
Tp. Hồ Chí Minh (n = 
113) 
Tổng cộng (N = 240) 
Sinh hóa m-PCR1 Sinh hóa m-PCR1 Sinh hóa m-PCR1 
n % n % n % n % n % n % 
Tôm 13 34,2 13 34,2 14 42,4 14 42,4 27 38,0 27 38,0 
Nhuyễn thể 34 38,2 40 44,9 38 47,5 39 48,7 72 42,6 79 46,7 
Chung 47 37,0 53 41,7 52 46,0 53 46,9 99 41,3 106 44,2 
Dung dịch nước pepton muối kiềm bổ sung polymycin B 50UI và 3% NaCl 
(Môi trường 2) 
Địa điểm 
Phương 
pháp 
 Loại mẫu 
Đồng Nai (n = 127) 
Tp. Hồ Chí Minh (n = 
113) 
Tổng cộng (N = 240) 
Sinh hóa m-PCR1 Sinh hóa m-PCR1 Sinh hóa m-PCR1 
n % n % n % n % n % n % 
Tôm 0 0,00 4 10,5 5 15,2 12 36,4 6 8,4 17 23,9 
Nhuyễn thể 8 8,9 50 56,2 12 15,0 43 53,7 18 10,7 93 55,0 
Chung 8 6,3 54 42,5 17 15,0 55 48,7 24 10,0 110 45,8 
Ghi chú: Tôm: n = 71 (Đồng Nai: 38 mẫu; TP. Hồ Chí Minh: 33 mẫu) 
 Nhuyễn thể: n = 169 (Đồng Nai: 89 mẫu; TP. Hồ Chí Minh: 80 mẫu) 
 Bảng 3. Kết quả số mẫu dương tính với các gen trong phản ứng m-PCR2 sử dụng 
 54 
thời gen ctxA cùng với rfbO1 và rfbO139 mà ở môi trường 1 không giúp phát hiện được; 
hoặc 2 mẫu ở môi trường 1 so với 4 mẫu ở môi trường 2 đối với gen rfbO1; hoặc 2 mẫu 
ở môi trường 1 so với 4 mẫu ở môi trường 2 đối với gen rfbO139, hoặc 13 mẫu ở môi 
trường 1 so với 18 mẫu ở môi trường 2 đối với gen ctxA. 
Kết quả dương tính đồng thời của gen ctxA và gen rfbO1 hoặc/ và rfbO139 cho 
thấy khả năng hiện diện các V. cholerae mang gen độc lực trong mẫu khảo sát. Nhằm 
xác định sự hiện diện của các serogroup này trong mẫu khảo sát, m-PCR2 được tiến 
hành với DNA của 375 gốc (tương ứng 123 mẫu thực địa) V. cholerae đã được định 
danh (Bảng 4). 
Bảng 4. Tần số xuất hiện V. cholerae O1 và O139 trên mẫu khảo sát 
 (DNA của từng gốc định danh bằng sinh hóa) 
Serogroup của V. cholerae 
Môi trường 1 
 (n = 99) 
Môi trường 2 
(n = 24) 
n % n % 
V. cholerae O1 có độc tố CT (ctxA + rfbO1) 0 0,0 0 0,0 
V. cholerae O139 có độc tố CT (ctxA + rfbO139) 5 5,0 3 9,4 
V. cholerae O1 không có độc tố CT (rfbO1) 3 3,0 2 8,3 
V. cholerae O139 không có độc tố CT (rfbO139) 8 8,1 3 12,5 
V. cholerae non – O1/139 có độc tố (ctxA) 5 5,0 2 8,3 
Kết quả Bảng 4 cho thấy 5 mẫu ở môi trường 1 và 3 mẫu ở môi trường 2 được 
xác định sự hiện diện của V. cholerae serogroup O139 có độc tố CT, không có mẫu nào 
phát hiện được V. cholerae serogroup O1 sinh độc tố CT. Ngoài ra, có 3 mẫu ở môi 
trường 1 và 2 mẫu môi trường 2 hiện diện V. cholerae serogroup O1 không sinh độc tố 
CT; 8 mẫu ở môi trường 1 và 3 mẫu môi trường 2 hiện diện V. cholerae serogroup 
O139 không sinh độc tố CT; 5 mẫu ở môi trường 1 và 2 mẫu môi trường 2 hiện diện V. 
cholerae thuộc các serogroup non – O1/ non – O139 sinh độc tố CT. 
3.3 Xác định biotype của V. cholerae O1 trên mẫu tôm và nhuyễn thể cho kết quả 
dƣơng tính với V. cholerae O1 ở m-PCR 2 
DNA của các mẫu dương tính đồng thời ít nhất hai gen ctxA và rfbO1 ở phản ứng 
m-PCR2 (2 mẫu ở môi trường 1 và 4 mẫu ở môi trường 2, xem Bảng 3) được sử dụng 
để xác định biotype của V. cholerae O1. Kết quả cho thấy 1 mẫu ở môi trường 1 và 2 
mẫu ở môi trường 2 cho kết quả dương tính với gen tcpA đặc trưng cho V. cholerae O1 
biotype El Tor, không mẫu nào cho kết quả với tcpA đặc trưng cho V. cholerae O1 
biotype cổ điển (Hình 3). 
Thảo luận 
Phương pháp PCR cho kết quả phát hiện V. cholerae chính xác và nhạy hơn 
nhiều so với phương pháp sinh hóa. Lý do là phương pháp PCR có thể phát hiện được 
các dòng V. cholerae tồn tại hoặc không tồn tại trên môi trường phân lập (Lipp và cs, 
2003). Bên cạnh đó, phương pháp PCR sử dụng DNA tách chiết từ dung dịch tăng sinh 
sẽ cho kết quả phát hiện V. cholerae nhanh hơn, chính xác và độ nhạy cao hơn so với 
phương pháp nuôi cấy truyền thống (Lipp và cs, 2003). Tuy vậy, khi sử dụng DNA tách 
chiết từ dung dịch tăng sinh để thực hiện phản ứng m-PCR thì không thể khẳng định sự 
tồn tại của các serogroup của V. cholerae mang gen độc lực mà chỉ cho thấy nguy cơ 
hiện diện của các dòng vi khuẩn này trong mẫu khảo sát. 
Tần số xuất hiện của V. cholerae trong mẫu tôm và nhuyễn thể ở hai địa bàn 
khảo sát khá cao (Bảng 2). Tuy nhiên, khả năng xuất hiện của các serogroup mang gen 
độc lực của V. cholerae trong mẫu khảo sát rất thấp (Bảng 3 và Bảng 4). Điều đó cho 
thấy các serogroup của V. cholerae tồn tại trong mẫu khảo sát cũng như trong môi 
 55 
trường chủ yếu là non-O1, O139 (Goel và cs, 2010) hoặc những dòng V. cholerae O1 
và O139 không sinh độc tố CT (Kaper và cs, 1995). Tỷ lệ phát hiện gen sodB của V. 
cholerae trong phân vật nuôi là 32% (74/230 mẫu), trong số này, chỉ phát hiện 20/74 
mẫu có mang gen rfb của V. cholerae O1 và không có mẫu nào dương tính với V. 
cholerae O139 (Keshav và cs, 2010). 
Chúng tôi tiến hành định biotype của 6 mẫu cho kết quả dương tính đồng thời 
với ít nhất 2 gen của V. cholerae O1, nhưng chỉ có 3 mẫu cho kết quả dương tính với 
gen tcpA (Hình 3). Thật vậy, trái với nghiên cứu trước đây cho rằng hầu hết các dòng 
V. cholerae O1 đều cho kết quả dương tính với ctxA và tcpA (Faruque và cs, 1998), 
37% số mẫu được xác định là V. cholerae O1 đã không hiện diện gen ctxA và tcpA 
(Aulet và cs, 2007). Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh một số dòng Vibrio 
cholerae non-O1/ non-O139 cũng có khả năng mang đồng thời hai gen độc lực ctxA và 
tcpA (Singh và cs, 2001). 
Kết quả nghiên cứu cho thấy không có mẫu nào (dung dịch tăng sinh hoặc gốc 
phân lập được) cho kết quả dương tính với V. cholerae O1 biotype cổ điển. Từ năm 
1961, V. cholerae O1 biotype El Tor đã thay thế V. cholerae O1 biotype cổ điển trong 
các ổ dịch tả (Alm và Manning, 1990). Hầu hết các gốc phân lập từ Việt Nam và 
Bangladesh đều là El Tor (Minh và cs, 2009). Tuy nhiên, không phải tất cả các nghiên 
cứu đều cho thấy V. cholerae O1 biotype cổ điển đã biến mất mà chúng vẫn đang tồn 
tại. Nghiên cứu của Safa và cs (2008) khảo sát 41 dòng V. cholerae O1 phân lập ở châu 
Á và châu Phi từ năm 1991 đến năm 2004 cho thấy tất cả các dòng đều cho kết quả 
dương tính với gen rfb O1, hầu hết mang gen tcpA đặc hiệu cho biotype cổ điển 
(451bp) ngoại trừ 5 dòng ở Việt Nam đều mang tcpA El Tor. 
3.3 Kết quả kháng sinh đồ của V. cholerae định danh đƣợc 
Nghiên cứu đã tiến hành thử kháng sinh đồ để đánh giá tính nhạy cảm của 9 gốc 
V. cholerae định danh được đối với các loại kháng sinh thường sử dụng để điều trị bệnh 
tả. Kết quả kháng sinh đồ của các gốc V. cholerae định danh được thể hiện qua Bảng 5. 
Bảng 5. Tính nhạy cảm của V. cholerae với một số loại kháng sinh (n = 9) 
Kháng sinh 
Nhạy Trung gian Kháng 
n % n % n % 
Amoxicillin 3 33,3 2 22,2 4 44,4 
Cloramphenicol 7 77,8 1 11,1 1 11,1 
Colistine 0 0,0 0 0,0 9 100,0 
Doxycycline 9 100,0 0 0,0 0 0,0 
Gentamicin 8 88,9 0 0,0 1 11,1 
Norfloxacin 9 100,0 0 0,0 0 0,0 
Oxacillin 1 11,1 0 0,0 8 88,9 
Polymycin B 3 33,3 0 0,0 6 66,7 
Trimethoprim/sulfamethoxazol 4 44,4 0 0,0 5 55,6 
Vancomycin 2 22,2 3 33,3 4 44,4 
Kết quả cho thấy V. cholerae nhạy cảm hoàn toàn với doxycycline và 
norfloxacin (100%); khá nhạy cảm với gentamicin (88,9%) và cloramphenicol (77,8%); 
đề kháng hoàn toàn với colistine (100%) và đề kháng cao với oxacillin (88,9%) và 
tương đối kháng polymycin B (66,7%), vancomycin (44,4%) và 
trimethoprim/sulfamethoxazole (55,6%). 
Vấn đề đề kháng kháng sinh của V. cholerae đã được rất nhiều tác giả nghiên 
cứu trước đây, kết quả cho thấy khả năng đề kháng của vi khuẩn này rất đa dạng, tùy 
thuộc vào thời gian và địa điểm nghiên cứu. Ở nước ta, các dòng V. cholerae O1/non-
O1 từ năm 1995- 2002 đề kháng với streptomycin, sulfamethoxazole/trimethoprim 
 56 
(Ehara và cs, 2004), các dòng phân lập năm 2003 thì đề kháng với amoxicillin và 
erythromycin (Bani và cs, 2007). 
V. cholerae phân lập ở Bangladesh 2002-2008 đề kháng với tetracycline, 
ciprofloxacin, sulfamethoxazole/trimethoprim, erythromycin và furazolidone (Kim và 
cs, 2010). Theo Ang và cs (2010) các dòng V. cholerae O1 El Tor phân lập được ở 
Malaysia năm 2009 có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh bao gồm 
tetracycline, erythromycin, streptomycin, penicillin G, sulfamethoxazole/trimethoprim 
và polymycin B. Gần đây nhất, V. cholerae O1 ở Indonesia đề kháng với erythromycin 
nhưng nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh ampicillin, ciprofloxacin, cloramphenicol, 
tetracycline, gentamicin, kanamicin, sulfamethoxazole/trimethoprim, norfloxacin, 
streptomycin và axit nalidixic (Nishibori và cs, 2011). 
IV KẾT LUẬN 
Môi trường nước muối pepton kiềm là môi trường tăng sinh hiệu quả để định 
danh V. cholerae bằng phương pháp sinh hóa, bổ sung polymycin B và 3% NaCl vào 
môi trường này rất có ích cho việc phát hiện các gen độc lực của loài vi khuẩn này bằng 
phương pháp m-PCR. 
Tần số xuất hiện của V. cholerae trong mẫu tôm và nhuyễn thể khá cao (hơn 
40%) nhưng sự hiện diện của các serogroup O1, O139 sản sinh độc tố CT trong mẫu 
khảo sát rất thấp (5 mẫu ở môi trường 1 và 3 mẫu ở môi trường 2). 
Chỉ phát hiện được gen tcpA đặc trưng cho V. cholerae O1 biotype El Tor ở 3/6 
mẫu khảo sát, không mẫu nào cho kết quả dương tính với tcpA đặc trưng cho V. 
cholerae O1 biotype cổ điển. 
Một số gốc V. cholerae phân lập được đều nhạy cảm doxycycline và 
norfloxacin và đề kháng hoàn toàn với colistine, đề kháng cao với oxacillin. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.Alam M., Sultana M., Nair G. B., Sack R. B., Sack D. A., Siddique A. K., Ali A., 
Huq A. and Colwell R. R., 2006. Toxigenic Vibrio cholerae in the aquatic environment 
of Mathbaria, Bangladesh. Applied and Environmental Microbiology 72 (4): 2849-
2855. 
2.Ang G. Y., Yu C. Y., Balqis K., Elina H. T., Azura H., Hani M. H. and Yean C. Y., 
2010. Molecular evidence of cholera outbreak caused by a toxigenic Vibrio cholerae 
O1 El Tor variant strain in Kelantan, Malaysia. Journal of Clinical Microbiology 48 
(11): 3963-3969. 
3.Bani S., Mastromarino P. N., Ceccarelli D., An L. V., Salvia A. M., Tram N. V. Q., 
Hai D. H., Bacciu D., Cappuccinelli P. and ColomboM. M., 2007. Molecular 
characterization of Vibrio cholerae and its disappearance in Vibrio cholerae O1 strains 
isolated in 2003 in Vietnam. FEMS Microbiology Letters 266: 42-48. 
4.Ehara M., Nguyen B. M., Nguyen D. T., Toma C., Higa N. And Iwanaga M., 2004. 
Drug susceptibility and its genetic basis in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam. 
Epidemiology and Infection 132: 595-600. 
5.Faruque S. M., Albert M. J. and Mekalanos J. J., 1998. Epidemiology, genetics and 
ecology of toxigenic Vibrio cholerae.Microbiology and Molecular Biology Reviews 
62(4): 1301-1314. 
6.Kim H. B., Wang M.,Ahmed S., ParkC.H., LaRocque R. C.,Faruque A. S., Salam M. 
A., Khan W. A., Qadri F., Calderwood S. B., Jacoby G. A. and Hooper D. C., 
2010.Transferable quinolone resistance in Vibrio cholerae. Antimicrobial Agents and 
Chemotherapy 54 (2): 799-803. 
 57 
7.Minh N. B., Lee H. J., Cuong N. T., Choi Y. S., Hien N. T., Anh D. D., Lee R. H., 
Ansaruzzaman M., Endtz P. H., Chun J., Lopez L. A., Czerkinsky C., Clemens D. J. and 
Kim W. D., 2009. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 EI Tor 
biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. Journal of 
Clinical Microbiology 47(5): 1568-1571. 
8.Nishibori T.,Cores de Vries G., Rahardjo D., Wasito E. B., De I., Kinoshita S., 
Hayashi Y., Hotta H., Kawabata M., Shirakawa T., Iijima Y. and Osawa R., 2011. 
Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae clinically isolated in 
Surabaya, Indonesia. Indonesia – Japan journal infectious diseases 64: 7-12. 
9.Singh D. V., Matte M., Matte g. R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B. N., Sanyal S. 
C., Huq A. and Colwell R. R., 2001. Molecular analysis of Vibrio cholerae O1, O139, 
non – O1, and non – O139 strains: clonal relationships between clinical and 
environmental isolates. Applied and Environmental Microbiology 67 (2): 910-921 
10.Tarr C. L., Patel S. J., Puhr N. D., Sowers E. G., Bopp C. A. and Strockbine N. A., 
2007. Identification of Vibrio isolates by a multiplex PCR assay and rpoB sequence 
determination. Journal of Clinical Microbiology 45 (1): 134-140.