Phát triển chỉ thị phân tử SCAR nhận diện loài Vibrio vulnificus gây bệnh lở loét trên cá nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế

ới các mồi ngẫu nhiên 
Mũi tên chỉ các băng đặc hiệu; M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA 1 kb ladder, Thermo Fisher 
Scientific). A. mồi OPA-03 và OPA-09; B. mồi OPG-17 và OPN-03. 
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
104 
Từ những kết quả này, chúng tôi thiết kế các 
cặp mồi đặc hiệu dựa trên so sánh trình tự của 
chúng tôi với các chủng thu được ở trên. Các cặp 
mồi được thiết kế để thu được các đoạn đặc hiệu 
có kích thước khác nhau (Bảng 3). Các mồi này 
được sử dụng để khuếch đại DNA tổng số của sáu 
chủng V. vulfinicus và các chủng hiện có khác như 
V. paraheamoliticus, V. harveyi, V. cholerae Mục tiêu 
là chọn ra được các đoạn đặc hiệu có kích thước 
vừa phải thỏa mãn điều kiện xuất hiện ở cả sáu 
chủng V. vulfinicus mà không xuất hiện ở các chủng 
khác.
CP017919 1 ACCTCTGCTCGATTAAAACGTAAGTGCCATTCGTTCA-GCGTCTTGGCGTAGTCCAAACC 60 
CP014134 TCTTCAGCTTGATTAAATCTAGAGTGCCACTCGCTCA-AGGTTTTCGCATAGTCCAGACC 
CP045070 -------ATTGATTAAAGCGGTGGTGCCATTCGTTAA-GCGTCTTGGCGTAATCCAACCC 
CP009977 TCCTCAGCTTGATTAAACCGGCGATGCCATTCATTGA-GTGTTTTCGCATAATCGAGGCC 
CP018616 CTTTGTGCCTGATTAAAACGCTGATGCCACTCATTAA-GTGTCTTGGCATAATCCAACCC 
CP023485 TCGGAACACCAATTCAAACAGTAAAAGTGATGGTTGGAATCTACTGGCATGCGTTGAGGT 
CP032213 TCGTTACACCAATACAAACGGTAAAAGTAATGGTTGGTATTTATTGGCACGCATTAAAAC 
Vvul GGGTAACGCCTATTCAAACAGTAAAAGTGTTGGTAGGGATTTACTGGCATGCGTTCAAAC 
 Vvul-1F→ ** ** * * * * ** 
CP017919 61 AATATCGAACAAGTCTCGCGTCACTAAGTCACTGTATTTTGTTGTGGCTTGGGTTAGTGA 120 
CP014134 AATATCAAATAAGTCTCTCACCACCAAGTCACTGTATTTGGTCGCAGCTTGAGTTAAAGA 
CP045070 AATATCAAACAAGTCTCGCGTCACCAAGTCACTGTGTTTAGTTGTTGCTTGGGTGAGTGA 
CP009977 GATATCGAACAGGTCTCGAACAACAAGATCACTGTACTTTGTCGCCGCTTGAGTCAGAGA 
CP018616 AATATCAAACAGGTCTCTAACCACAAAGTCACTGTACTTGGTCGTCGCCTGAGTTAATGC 
CP023485 TATGGATTAAAGGTGCGCCGTTTTATTCCCACCCTAAATATTTGACGACCAATGAACGTC 
CP032213 TTTGGGTGAAAGGCGCACCTTTTTATTCTCATCCTAAATATTCAACGCATGAAGAAATAG 
Vvul TGTGGAAAAAAGGTGCACCATTTTACTCGCATCCCAAATAC-CGCTCTCCAACCAAC—C 
 * * * * ** * Vvul-101F→ * 
CP017919 121 GGTTACCGACGGTAAAAAACCACCCGGGAAAATGTACTTTTGGATAAAGTCGACGTTGTT 180 
CP014134 TGTAACCGAAGGTAAGAACCCACCTGGAAAGATGTATTTCTGAATAAAGTCAACGTTGTT 
CP045070 CGTTACCGAAGGTAAAAAGCCGCCGGGGAAAATGTACTTCTGAATGAAGTCGACATTGTT 
CP009977 AGTCACTGAAGGTAAAAATCCACCTGGAAATATGTACTTTTGAATAAAATCGACGTTATT 
CP018616 GGTAATAGAAGGTAGGAAACCACCTGGGAAAATATATTTTTGAATAAAATCAACACTATT 
CP023485 AA--GCCTCTAGCGACAAATAAGATAAGAAAA---AT-----AATAAGCACAAGGAGAAT 
CP032213 AA--GCCGATATTGAAAAAACAGACAAAAAAA---AT-----AAAAAGCACAAGGAGAAT 
Vvul GG--ACTGAGAGTAACAACTAAACTGTGAAGA---AT-----AATAAAGTTAGGGAGAAT 
 ** ** * * * * * 
CP017919 361 TTTGAGTAGCGTGATTTTGTCTTCTAAGCCACGCTCTTTGATTTTTTGCTCCGCGTACGC 420 
CP014134 TTTTAATAGAGTGATCTTGTCGCCCAAATTTCGCTCTCTAATTTTTTGTTCAGCGTAAGC 
CP045070 TTTGAGCAAGGTAATTTTGTCGGTCAAACCACGCTCATTTATCTTCTGTTCTGCGTAGGC 
CP009977 TTTAAGCAAGGTGATTTTATCCGACAAGCCTTTCTCTTCAATCTGTTGCTTGGCGTAGGC 
CP018616 TTTAAGCAACGTAATCTGATCCATTAAACCTCTTTGTTTGATCAGTTCTTCGGTATAAAG 
CP023485 TTACTGCGCCAAACGGAGAATACAGTGGCCAACCTGTCGTTGCGACCATTGAGGTTAAGC 
CP032213 TTAGTGCGCCAAATGGGGAGTACAGTGGTCAACCTGTTGTCGCTACTATAGAGGTAAAAC 
Vvul TTGTAGGGGTCCACAATCACAAGCCGGGTGTGGCAATTAGCGCAACAATAGAAGTCAAAC 
 ** Vvul-350F→ ←Vvul-368R * 
CP017919 541 TCAAGTTGCTGACATAGACGATCCATTTTGTTGATTTGAGCCTGCTCTAGAGAGTCATCC 600 
CP014134 TCAAGTTGCTGGCACAAACGATCCATTTTGTTGATTTGCGCTTGTTCCAAAGTATCGTTG 
CP045070 TCAAGTTGTTGACACAGGCGTTCCATCTTATTGATTTGCGCCTGCTCTAATGAGTCATCC 
CP009977 TCGATCTGTTGGCAAAGACGATCCATTTTATTGATTTGCGCCTGCTCTAGTGACTCACTA 
CP018616 GCCAATTGTTGACATAGCCGCTCCATTTTATTGATTTGAGCCTGTTCTAAGCTATCACTG 
CP023485 ATGCGGGCCCTTGATAAGCTTGAGGAGCAGGGTAGTTG-GCTTACCAAGTTACTTTATAA 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 105 
CP032213 ATGCGTGCTTTAGATAAACTCGAAGAGCAAGGCAGTTG-GTTGACTAAAATACTGTACAA 
Vvul CTGAATGCATTAGATGGATTAGAAAACCAAAGTAGCTG-GGTCACCGAACTGCTTTACAA 
 * * ** * Vvul-549F→ 
CP017919 601 GCATGATTGTAAAGCGCCGACGAATACAGCATATTGATATCAAGGAACGCTTCGTATAGG 
CP014134 TCTTGCACATATAAGGCCGATGAGTACAGCATGTTGTCGTCTAAAAATGACTCGTACAAA 
CP045070 ACTTGGTTGTACAGGGCCGACGAGTACAGCATATTCGTATCAAGAAATGCTTCATACAAA 
CP009977 CCTTGGCGATAAAGCGCAGATGAATAGAGCATATTACTGTCTAGAAATGACTCATACAGC 
CP018616 TCTTGAAGGTATAAAGCCGAGGAGTAGAGCATTCTTTCATCAAGAAACGTCTCATAAAGC 
CP023485 GTTTAGCCATTGGACGAATCGAAACTCGCAAGAAAACTCTCGGAAGAACATCCATGCTCA 
CP032213 GTTCAGTCATTGGTCAAACAGAAACTCTGAAGAGAACTCACGTAAAAATATCCATGCGCA 
Vvul ACTCAGTCATTGGAGCAATCGAAATACGCAGGAAAACTCGCGTAAAAATATTCATGCCCA 
 * * * * * * 
CP017919 901 GCCCTGCAAGATCCGTGAATAAAAGCCTGGATGTTTTACCTCTATAGTAGCGACAACAGG 
CP014134 ACCTTGCAAGATTCGCGAGTAAAAGCCAGGATGCTTTACCTCAATCGTCGCCACAACAGG 
CP045070 GCCCTGTAGAATTCGGGAGTAGAACCCCGGATGCTTAACTTCAATAGTTGCAGCAACGGG 
CP009977 ACCTCGTAAAATACGTGAGTACAAACCGGGATGTTTCACCTCGATGGTCGCCGACACAGG 
CP018616 ACCTTGTAAAATCCGCGAGTAAAATCCAGGGTGCTTGACCTCAATTGTCGCTGCAGCAAG 
CP023485 ATTTCGGAAGAGCAGTATGAGTATGCTCGACAGCAAATCGTACAACGAGGTTTAGCCGAT 
CP032213 ATATCTGAAGAGCAACACGCGTACGCGGAGCAAAAAATCATAGAGCGTGGCTTAGAAGAC 
Vvul ATTTCAGATGAGCAATATGACTACGCAAAACAACAGATTGCAGAAAGAGGTTTGACTGAG 
 * * * * * * * 
CP017919 961 TTGACCACTGTACTCCCCATTTGGCGCACTAAAACGCTCGCTTCGCTCTGTCGTTTCCGT 
CP014134 CTGACCGCTGTATTCACCGTTGGGCGCATTAAAGCGCTCGCTTCTTTCTTTCGTTTCCGT 
CP045070 TTCTCCGTTATGCTCACCATTGGGCGTCGAAAAACGCTCGCTACGCTCAGTCGTTTCTGT 
CP009977 CTCCTCGCGATACATACCAGCCGGTGCTGTAAATCGTTCGCTTCTTTCTGCTCCGCCGGA 
CP018616 GACACCATTGTGTTCAAGCATCTGGGTTGCGAATCGTTCACTCCGCTCTGTCGTGCCTGT 
CP023485 CGAATTACTTTACTTAAAGAAGACTACCGTAATCTTACTGGGACGTACGATAAATTGGTT 
CP032213 AAAATCACTCTACTCAAAGAAGATTACCGAAACCTAACCGGAACTTATGACAAGCTCGTT 
Vvul CGTATTCAGTTATTGAAGAAAGATTATCGAGATTTAACTGGGCAGTTTGATAAATTGGTT 
 ←Vvul-938R * * 
CP017919 1380 TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTTTGTATTGGTGTAA 1430 
CP014134 TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTCTGTATTGGCGTAA 
CP045070 TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTTTGAATCGGCGTAA 
CP009977 TGCGTGCCAGTAAATGCCAAACACCACTTTGACTGTTTGTATCGGTGTGA 
CP018616 TGCATGCCAATAGATACCCACCATCACTTTTACCGTTTGAATAGGAGTTA 
CP023485 GTACGAGGGTTTGGGTACGATGACCGGTTTGTCCGCATGTGGCGTTA--- 
CP032213 GTGCGCTCGTTTGGCTACGACGACCGCTTTGTGCGTATGTGGCGCTACTA 
Vvul GTAAAAAGACTAGGGTATGACGAGCGATTCATTCGTATGTGGCGTTACCC 
 * * * ** * ** * ←Vvul-1356R 
Hình 2. So sánh trình tự nucleotide của đoạn A9-1400 với các trình tự khác trên ngân hàng gen 
(các vùng thiết kế mồi) 
CP023485: V. parahaemolyticus FORC_071; CP017919: V. alginolyticus K09K1; CP032213: V. neocaledonicus CGJ02-2; 
CP014134: V. diabolicus LMG 3418; CP045070: V. harveyi WXL538; CP009977: V. natriegens NBRC_15636; CP018616: V. 
azureus LC2-005. Phần gạch chân là trình tự các mồi; tên mồi được thể hiện ngay bên dưới trình tự mồi. 
Từ Bảng 3, chúng tôi có tổng cộng tám tổ 
hợp PCR để tuyển chọn chỉ thị SCAR cho loài V. 
vulnificus. Trong tám cặp mồi, chỉ có hai cặp mồi là 
Vvul-1F/Vvul-1356R (Hình 3a) và Vvul-1F/Vvul-
938R (Hình 3c) là có sản phẩm khuếch đại ở cả sáu 
mẫu V. vulnificus và không có sản phẩm khuếch đại 
ở các mẫu đại diện khác; đây là các cặp mồi có thể 
sử dụng để làm chỉ thị SCAR. Trong hai cặp mồi 
này, chúng tôi ưu tiên sử dụng cặp mồi Vvul-
1F/Vvul-938R do có băng khuếch đại mạnh hơn và 
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
106 
kích thước ngắn hơn. Tất cả các cặp mồi còn lại đều 
không đạt tiêu chí làm chỉ thị cho loài V. vulnificus. 
Các cặp mồi này có sản phẩm khuếch đại tương tự 
ở loài Vibrio khác (ví dụ cặp mồi Vvul-1F/Vvul-
368R, Hình 3b) hoặc không có sản phẩm khuếch 
đại trên cả sáu chủng V. vulnificus (đối với các cặp 
mồi còn lại, số liệu không được trình bày chi tiết). 
Sau đó, cặp mồi được kiểm tra trên tất cả các loài 
Vibrio hiện có. Kết quả cho thấy băng đặc hiệu chỉ 
xuất hiện trên các mẫu thuộc loài V. Vulnificus mà 
không xuất hiện ở các loài Vibrio khác (Hình 4). 
Hiện nay, các phương pháp định danh phân 
tử cho các loài Vibrio spp. đã được công bố, bao 
gồm xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung 
gian vòng (loop-mediated isothermal 
amplification-LAMP) cho V. parahaemolyticus [14], 
multiplex PCR cho Vibrio spp. [15] hay V. vulnificus 
[16] PCR các gen đặc hiệu cho Vibrio spp. cũng 
đã được công bố [17] Tuy nhiên, chỉ thị SCAR 
cho các loài Vibrio spp. chưa được công bố ngoại 
trừ các nghiên cứu của nhóm chúng tôi.
Hình 3. Phản ứng PCR với các cặp mồi cho loài V. Vulnificus 
a. Vvul-1F/Vvul-1356R; b. Vvul-1F/Vvul-368R; c. Vvul-1F/Vvul-938R; d. Vvul-350F/Vvul-1356R; e. Vvul-549F/Vvul-
938R; f. Vvul-549F/Vvul-1356R; M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA 1 kb ladder, Thermo Fisher 
Scientific). 1. V. vulnificus VC15; 2. V. vulnificus VC17; 3. V. vulnificus VC21; 4. V. vulnificus VC28; 5. V. vulnificus VC37; 
6. V. vulnificus VC67; 7. V. paraheamoliticus; 8. V. harveyi; 9. V. cholerae; 10. Đối chứng (–). 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 107 
Hình 4. Phản ứng PCR với cặp mồi Vvul-1F/Vvul-938R. M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA 1 kb 
ladder, Thermo Fisher Scientific) 
1. V. vulnificus VC15, 2. V. vulnificus VC17, 3. V. vulnificus VC21, 4. V. vulnificus VC28, 5. V. vulnificus VC37, 6. V. vulni-
ficus VC67, 7. V. cholerae, 8. V. harveyi, 9. V. brasiliensis, 10. V. paraheamoliticus, 11. V. shilonii, 12. V. communis, 13. V. fur-
nissii, 14. V. fluvialis, 15. V. natriegens, 16. Đối chứng (–).
Trong nghiên cứu này, chỉ thị SCAR để phát 
hiện V. vulnificus một cách nhanh chóng và đặc 
hiệu cao đã được phát triển và được đặt tên là A9-
938. Có thể áp dụng các mồi SCAR đã được thiết 
kế để phát hiện trực tiếp các chủng V. vulnificus có 
trong mẫu. Độ đặc hiệu của nó được xác nhận bằng 
PCR với tám loài Vibrio khác nhau và chỉ thị A9-938 
chỉ xuất hiện duy nhất ở loài V. vulnificus mà không 
xuất hiện ở các loài khác. Chỉ thị này sẽ giúp việc 
xác định sự có mặt của các chủng V. vulnificus 
nhanh chóng và chính xác hơn phương pháp vi 
sinh cổ điển. So với phương pháp định danh bằng 
phân tích trích tự gen 16S rDNA với vùng bảo tồn 
của gen hemolysin hoặc cytolysin, phương pháp 
dùng chỉ thị SCAR có thời gian tiến hành ngắn hơn 
và giá thành thấp hơn do không phải phân tích 
trình tự gen. Chỉ thị này cũng có thể được sử dụng 
trong cả nghiên cứu dịch tễ lẫn phát triển các 
chương trình nuôi trồng thủy sản sau này. 
4 Kết luận 
Kết quả của nghiên cứu cho thấy mức độ đa 
hình cao khi phân tích RAPD các loài Vibrio khác 
nhau và một chỉ thị SCAR (A9-938) đã được phát 
triển dựa trên trình tự đặc hiệu 1356 bp cho loài V. 
vulnificus. Cặp mồi đặc hiệu (Vvul-1F/Vvul-938R) 
khuếch đại một đoạn DNA duy nhất trong tất cả 
các chủng V. vulnificus mà không xuất hiện ở các 
loài Vibrio khác. 
Thông tin tài trợ 
Công trình được thực hiện với sự tài trợ của 
Bộ Giáo dục và Đào tạo (Việt Nam) năm 2018–2020 
(Đề tài mã số CT-2018-DHH-01 và CT-2018-DHH-
02). 
Tài liệu tham khảo 
1. An NTT, Hải TN, Dung TT. Phân lập vi khuẩn Vibrio 
trên cá bớp (Rachycentron canadum) bị lở loét. Báo cáo 
tại: Hội nghị khoa học trẻ thủy sản toàn quốc lần thứ 
IV; 2013; Hồ Chí Minh. 
2. Li G, Zhao D, Huang L, Sun J, Gao D, Wang H, et al. 
Identification and phylogenetic analysis of Vibrio 
vulnificus isolated from diseased Trachinotus ovatus 
in cage mariculture. Aquaculture. 2006;261(1):17-25. 
3. Heng SP, Letchumanan V, Deng CY, Ab Mutalib NS, 
Khan TM, Chuah LH, et al. Vibrio vulnificus: An 
environmental and clinical burden. Frontiers in 
Microbiology. 2017;8:997-. 
4. Strom MS, Paranjpye RN. Epidemiology and 
pathogenesis of Vibrio vulnificus. Microbes and 
Infection. 2000;2(2):177-88. 
5. Ramazanzadeh R, Rouhi S, Shakib P, Shahbazi B, 
Bidarpour F, Karimi M. Molecular characterization 
of Vibrio cholerae Isolated from clinical samples in 
Kurdistan province, Iran. Jundishapur J Microbiol. 
2015;8(5):e18119-e. 
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
108 
6. Khanh NV, Linh NQ, Lan TT, Nhân LTT, Vân TQK, 
Cơ NTK, et al. Phân lập và sàng lọc các chủng Vibrio 
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 
trên tôm thẻ chân trắng nuôi tại Phong Điền, Thừa 
Thiên Huế bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA. Tạp chí 
Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên. 
2019;128(1E):47-58. 
7. Sairkar PK, Sharma A, Shukla NP. SCAR marker for 
identification and discrimination of Commiphora 
wightii and C. myrrha. Mol Biol Int. 2016;2016:1-10. 
8. Rossi CC, Pereira MF, Langford PR, Bazzolli DMS. 
A BOX-SCAR fragment for the identification of 
Actinobacillus pleuropneumoniae. FEMS Microbiology 
Letters. 2014;352(1):32-7. 
9. Kałużna M, Albuquerque P, Tavares F, Sobiczewski 
P, Puławska J. Development of SCAR markers for 
rapid and specific detection of Pseudomonas syringae 
pv. morsprunorum races 1 and 2, using conventional 
and real-time PCR. Appl Microbiol Biotechnol. 
2016;100(8):3693-711. 
10. Yang Y, Hu J, Chen F, Ding D, Zhou C. Development 
of a SCAR marker-based diagnostic method for the 
detection of the Citrus target spot pathogen 
Pseudofabraea citricarpa. BioMed Research 
International. 2018;2018:1-5. 
11. Aggarwal R, Gupta S, Banerjee S, Singh V. 
Development of a SCAR marker for detection of 
Bipolaris sorokiniana causing spot blotch of wheat. 
Canadian journal of microbiology. 2011;57:934-42. 
12. Quang HT, Lan TT, Hai TTH, Yen PTH, Van TQK, 
Tung HT, et al. Genetic diversity and toxic genes 
analysis of Vibrio spp. isolated from white leg 
shrimp and marine fishes cultured in Tam Giang 
lagoon in Thua Thien Hue province, Vietnam. 
Indian Journal of Science & Technology. 
2020;13(13):1412-22. 
13. Quảng HT, Lan TT, Thi PTD, Nhân LTT, Ngọc LMT, 
Trâm NDQ, et al. Xác định sự hiện diện của các gen 
độc tố ở các chủng Vibrio gây bệnh hoại tử gan tụy 
cấp tính trên tôm tại Thừa Thiên Huế. Tạp chí Khoa 
học, Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên. 
2020;129(1A):115-123. 
14. Anupama KP, Chakraborty A, Karunasagar I, Maiti 
B. Loop-mediated isothermal amplification assay as 
a point-of-care diagnostic tool for Vibrio 
parahaemolyticus: recent developments and 
improvements. Expert Review of Molecular 
Diagnostics. 2019;19(3):229-39. 
15. Kim HJ, Ryu JO, Lee SY, Kim ES, Kim HY. Multiplex 
PCR for detection of the Vibrio genus and five 
pathogenic Vibrio species with primer sets designed 
using comparative genomics. BMC Microbiology. 
2015;15(1):239-50. 
16. Tsai YH, Chen PH, Yu PA, Chen CL, Kuo LT, Huang 
KC. A multiplex PCR assay for detection of Vibrio 
vulnificus, Aeromonas hydrophila, methicillin-resistant 
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, and 
Streptococcus agalactiae from the isolates of patients 
with necrotizing fasciitis. International Journal of 
Infectious Diseases. 2019;81:73-80. 
17. Alramahy SK. Molecular diagnostics for Vibrio 
cholera based on recA gene isolated from human in 
Diwaniyah city. Journal of Pharmaceutical Sciences 
and Research. 2018;10:1125-7.