Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất

ạch sau đó cho vào 
tủ ấm 28ºC và tiến hành đếm số lượng khuẩn 
lạc sau 36h nuôi cấy, tính mật độ vi khuẩn theo 
công thức:
A (tế bào/ml) = (a + b)/2 x 10 x D
Trong đó: A là mật độ vi khuẩn (tế bào/ml)
a, b là số khuẩn lạc mọc trên đĩa 1 và đĩa 2 
ứng với độ pha loãng đã được xác định.
D = độ pha loãng
90 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lực 
của vi khuẩn
Mục đích của thí nghiệm này là để so sánh 
độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân 
lập được . Thí nghiệm được bố trí trên bể kính. 
Mỗi bể kính chứa 20 cá có trọng lượng trung 
bình là 20 g. Cá thí nghiệm được tiêm canh 
khuẩn với liều 104, 105 và 106 CFU/0,2 ml/cá. 
Cá đối chứng được tiêm với nước muối sinh lý. 
Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lập lai 3 lần. 
Sau khi tiêm, cá được bố trí vào các bể kính và 
cho nhịn đói trong vòng 6 giờ. Sau đó, cá được 
cho ăn bình thường. Theo dõi cá chết hàng ngày 
sau khi tiêm và kết thúc thí nghiệm sau 2 tuần. 
Thu mẫu cá chết ở mỗi bể vào các ngày cá chết 
tập trung, thu ngẫu nhiên mỗi cá/bể cho phân 
tích vi khuẩn kiểm tra tác nhân gây bệnh.
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phân lập, định danh vi 
khuẩn từ mẫu cá tra bệnh 
Kết quả phân lập E. ictaluri qua 4 đợt thu 
mẫu thu được 04 chủng E. ictaluri I, II, III và IV. 
Kết quả kiểm tra sinh hóa từ 4 chủng vi khuẩn 
này được trình bày ở bảng 2. Các chủng E. 
ictaluri này đều gây tan huyết trên môi trường 
thạch máu, khuẩn lạc nhìn rõ sau 36-48 giờ cấy 
trên đĩa thạch (Hình 1) và khi nhuộm Gram cho 
thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn Gram âm.
Bảng 2. Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri
Phản ứng
Chủng vi khuẩn
E. ictaluri I E. ictaluri II E. ictaluri III E. ictaluri IV
ONPG + + + -
ADH - - - -
LDC - + + +
ODC - - - -
CIT + + + d
H
2
S - - - -
URE - - - -
TDA - - - -
VP + + + d
GEL + + + -
GLU + + + +
MAN - d d -
INO - - - -
SOR - - - -
RHA - - - -
SAC - d d -
MEL + - - -
AMY - d d -
ARA + d d -
NIT + + + -
O/F +/+ +/+ +/+ +/+
LAC + + + +
NO3 + + + +
ESCULIN + + + -
Ghi chú: (-): âm tính, (+) dương tính, d: dương tính không rõ.
91TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri I, II, II, IV trên môi trường thạch máu
Kết quả kiểm tra bằng PCR 16S rRNA của 
E. ictaluri (Panangala và cvt., 2007) cho thấy cả 
4 chủng E. ictaluri cho sản phẩm khuếch đại có 
kích thước 407 bp, tương ứng với chủng chuẩn 
E. ictaluri LMG7860 (Hình 2).
Hình 2. Điện di sản phẩm PCR. M: DNA 
100bp plus (ABM, Canada), chứng âm (-) sử 
dụng nước cất, chứng dương (+) DNA vi khuẩn 
E. ictaluri LMG7860 (Đại học Ghent, Bỉ)
3.2. Kết quả khảo sát độc lực của các 
chủng vi khuẩn E. ictaluri
Ở thí nghiệm này, với liều tiêm 106 CFU/
cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm. Chủng E. 
ictaluri I cho tỷ lệ chết sớm nhất và cao nhất 
so với các chủng vi khuẩn còn lại (Đồ thị 1). 
Chủng E. ictaluri III cho tỉ lệ chết thấp có ý 
nghĩa thống kê (p<0,05) so với các chủng còn 
lại (phương pháp Ducan).
Ở liều tiêm 105 CFU/cá cho tỷ lệ chết chậm 
hơn, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm 
và tập trung nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5 
sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác 
thì chủng I cho tỷ lệ chết cao nhất và sớm nhất 
so với các chủng còn lại (Đồ thị 2), tuy nhiên 
không khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi sử 
dụng phương pháp thống kê Duncan.
Đồ thị 1. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri liều 106 CFU/cá
92 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Đồ thị 2. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri 
liều 105 CFU/cá
Ở liều gây nhiễm 104 CFU/cá, cá bắt đầu 
chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày 
4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn 
thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao nhất 
(50%) so với các chủng còn lại và chủng I cho 
tỷ lệ chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Tỉ 
lệ chết giữa các chủng E. ictaluri cũng không 
cho khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi dùng so 
sánh Duncan (Đồ thị 3).
Kết quả kiểm tra LD
50
 của các chủng vi 
khuẩn thử nghiệm cho thấy độc lực nằm trong 
khoảng 1,9-3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá) (Bảng 3).
Đồ thị 3. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri 
liều 104 CFU/cá
93TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3. Giá trị LD
50
 của các chủng E. ictaluri
Chủng vi khuẩn LD
50 
Edwardsiella ictaluri I 1,9 x104 (CFU/0,2 ml/cá)
Edwardsiella ictaluri II 3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá)
Edwardsiella ictaluri III 3,4 x104 (CFU/0,2 ml/cá)
Edwardsiella ictaluri IV 2 x104 (CFU/0,2 ml/cá)
Ngoài ra, khi kiểm tra cá chết sau khi gây 
bệnh thực nghiệm bằng cách thu ngẫu nhiên 
mỗi bể một con để cấy vi khuẩn từ thận cá lên 
môi trường BA, kết quả sau 48 giờ cấy ủ ở 30°C 
chỉ có thuần một loại vi khuẩn E. ictaluri với 
kiểu tan huyết đặc trưng trên BA.
IV. THẢO LUẬN
Theo mô tả của Austin (2007), E. ictaluri 
có thể được phân lập từ thận, gan, lách, não và 
các vết thương trên da hay cơ của cá trên môi 
trường BHIA, thạch máu hay môi trường chọn 
lọc đối với E. ictaluri (EIM). Sau khi ủ ở 26°C 
trong 48 giờ, các khuẩn lạc của E. ictaluri có 
dạng tròn bóng, đường kính khoảng 2 mm, hơi 
cong, vành đầy đặn và không có sắc tố. Khi 
kiểm tra các đặc tính sinh hóa thì E. Ictaluri 
được xác đinh là vi khuẩn Gram âm, hình que, 
lên men và di chuyển bằng lông mao. E. Ictaluri 
có khả năng sản xuất các enzyme như catala-
se, P-galactosidase, lysine và ornithine decar-
boxylase nhưng không tạo H
2
S, indole, oxida-
se hay phenylalanine deaminase (Waltman và 
ctv., 1986). Qua phân tích 119 chủng E. ictaluri 
thu trong suốt 7 năm ở các bang của Mỹ, cho 
thấy các chủng này có độ tương đồng về đặc 
tính sinh hóa rất cao. Tất cả các chủng đều có 
khả năng phân hủy chondroitin sulfate, là thành 
phần chính của sụn, đây có thể là một yếu tố 
gây độc quan trọng trong việc hình thành nên 
tổn thương lỗ trên đầu đặc trưng của cá bệnh 
(Waltman và ctv., 1986; Cooper và ctv., 1996). 
Sự khác biệt về kiểu gene của 20 chủng E. ic-
taluri, 19 chủng thu từ cá nheo Mỹ và 1 chủng 
thu từ cá trê (Clarias batrachus) ở Thái Lan có 
đặc tính sinh hóa giống nhau, xác định bằng kỹ 
thuật arbitrary primed PCR (AP-PCR) kết hợp 
với mồi phát hiện vùng bảo tồn nằm trong vùng 
lặp lại của vi khuẩn đường ruột (ERIC II) cho 
thấy vi khuẩn này gồm 4 nhóm dưới loài (Ba-
der và ctv., 1998). Trong nghiên cứu này, cả bốn 
chủng mà chúng tôi phân lập đươc đều cho phản 
ứng dương tính với Citrate và VP. Kết quả này 
tương ứng với nghiên cứu của Thy và ctv., 2008 
khi phân lập E. ictaluri từ cá tra Việt Nam ở 5 
tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long 
và Bến Tre nhưng lại khác với mô tả của Hawke 
(1979) (Citrate và VP âm tính với E. ictaluri). 
Ngoài ra, bốn chủng E. ictaluri phân lập được 
cũng cho phản ứng dương tính với Lysine, âm 
tính với Arginine giống với các đặc tính của E. 
ictaluri mà Hawke (1979) mô tả. Cũng theo 
Hawke các phản ứng đường hầu hết là âm tính. 
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, một vài chủng 
cho dương tính nhẹ với amylase, arabinose và 
manitol. Sự khác biệt về một vài phản ứng sinh 
hóa này có thể là do sự khác biệt về các chủng 
vi khuẩn được phân lập từ các vùng địa lý khác 
nhau và sự biến chủng của vi khuẩn trong quá 
trình gây bệnh. 
Ngoài ra, nghiên cứu này đã gây bệnh thành 
công trên cá tra bằng 04 chủng E. ictaluri I, II, 
III, IV đã phân lập được. Cá được gây bệnh có 
biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài tự nhiên 
như màu sắc cá nhợt nhạt, mắt lồi, đôi khi xuất 
huyết bên ngoài cơ thể ở các gốc vây, quanh 
mắt, miệng, đuôi, hậu môn. Bên trong cơ thể 
có vô số đốm trắng với kích thước khác nhau từ 
1-3 mm xuất hiện đầu tiên trên thận, sau đó đến 
lách và gan. 
Qua khảo sát về độc lực của 4 chủng E. 
ictaluri phân lập được có thể thấy rằng vi 
94 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm 
nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau, tuy 
nhiên sự khác biệt này là không đáng kể. Nếu 
xét về thời gian thì chủng E. ictaluri I gây chết 
cá sớm hơn các chủng còn lại (cá bắt đầu chết 
từ ngày thứ 2 sau khi tiêm vi khuẩn) và nếu 
xét về LD
50
 thì chủng này cũng có giá trị thấp 
nhất mặc dù sự khác biệt với các chủng khác 
không có ý nghĩa thống kê (1,9 x104 CFU/0,2 
ml/cá). Theo giá trị LD
50
, hai chủng E. ictaluri 
I và IV có độc lực tương đương nhau khoảng 
2x104 CFU/0.2 ml/cá và cao hơn gần hai lần so 
với hai chủng E. ictaluri còn lại. Kết quả này 
khá tương đồng với các nghiên cứu khác ở Việt 
Nam. Như nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng 
Oanh và ctv., (2009) khi kiểm tra độc lực của 
9 chủng vi khuẩn E. ictaluri cũng cho thấy các 
chủng có độc lực cao thấp khác nhau. Kết quả 
nghiên cứu của Nguyễn Quốc Bình và ctv., 
(2010) cho thấy E. iclaturi có LD
50
 khoảng từ 
104-105 CFU/cá. Nguyễn Hữu Thịnh và ctv., 
(2009) nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm bằng 
phương pháp tiêm với liều tiêm từ dãy nồng độ 
5,5 x103 đến 5,5 x 106 (mỗi nồng độ pha loãng 
10 lần) cho tỷ lệ chết từ 93-99,3% và đối với 
gây bệnh bằng phương pháp ngâm cho tỷ lệ 
chết 66% ở liều 5,5 x 106 CFU/ml.
 V. KẾT LUẬN
Trong năm 2012 và 2013 nhóm nghiên cứu 
đã cập nhật được 04 chủng vi khuẩn E. ictaluri 
I, II, III, IV từ cá tra bệnh gan thận mủ thu tại 
các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu long. Các 
chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên 
cá tra với biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài 
tự nhiên. Đồng thời, nhóm cũng đã xác định 
được độc lực của các chủng E. ictaluri này. 
Trong đó, chủng E. ictaluri I và IV có độc lực 
cao hơn gần hai lần so với hai chủng E. ictaluri 
II và III.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009. 
Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân 
lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 
bệnh mủ gan, Hội thảo nghiên cứu tác nhân gây 
bệnh gan thận mủ ở cá tra 11/08/2009.
Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ thị Thanh 
Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, Trần 
Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ Hy Lan 
Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh Thanh, 
2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine phòng 
bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được triển khai 
tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố 
Hồ Chí Minh. Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn 
quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.
Tạp chí Thương Mại Thủy sản, số 131. Tháng 02/2013, 
ISSN 1859-1175
Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, 
Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thị Mai Thy, 2004. 
Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra 
(Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học 
Đại học Cần Thơ 2004, tr. 137 – 142.
Tài liệu tiếng Anh
Austin, B., and Austin, D.A., 2007. Bacterial Fish 
Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish, 4th. 
Springer and Praxis Publishing, Chichester, UK.
Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Connolly, 
M.A., and Barbaree, J.M., 1998. Genomic 
subtyping of Edwardsiella ictaluri isolated from 
diseased channel catfish by arbitrary primed 
polymerase chain reaction. Journal of Aquatic 
Animal Health 10, 22-21.
Cooper, R.K., Shotts, E.B. and Nolan, L.K., 1996. 
Use of a mini-transposon to study chondroitinase 
activity associated with Edwardsiella ictaluri. 
Journal of Aquatic Animal Health 8:319-324.
95TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Crumlish, Dung, M., Turnbull, T.J., Ngoc, N., and 
Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli 
from the diseased freshwater catfish Pangasius 
hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong 
Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25: 733-
736.
Hawke, J. P., McWhorter, A. C., Steigerwalt, A. G., 
and Brenner, D. J., 1981. Edwardsiella ictaluri 
sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia 
of catfish. International Journal of Systematic 
Bacteriology 31 (4): 396-400. 
Panangala, V. S., Craig, A.S., Vicky, L.V., Kevin, 
D., and Phillip, H.K., 2007. Multiplex-PCR 
for Simultaneous Detection of 3 Bacterial 
Fish Pathogens, Flavobacterium Columnare, 
Edwardsiella Ictaluri and Aeromonas hydrophila. 
Diseases of aquatic organisms 74(3):199–208.
Reed, M.J., and Muench, M., 1938. A simple method 
for estimating fifty percent endpoints. American 
Journal of hygiene 27: 493-497.
Thinh, N.H., Kuob, T.Y., Hung, L.T., Loc, T.H., 
Chen, S.C., Evensen, O., Schuurman, H.J., 
2009. Combined immersion and oral vaccination 
of Vietnamese catfish (Pangasianodon 
hypophthalmus) confers protection against 
mortality caused by Edwardsiella ictaluri. Fish & 
Shellfish Immunology 27: 773-776.
Waltman, W.D., Shotts, E.B., and Hsu, T.C., 1986. 
Biochemical characteristics of Edwardsiella 
ictaluri. Applied and Environmental Microbiology 
51:101-4.
96 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
inVesTigaTion, isolaTion and selecTion oF The mosT UPdaTed 
and ViRUlenT sTRains oF Edwardsiella ictaluri
Le Hong Phuoc1*, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Vo Hong Phuong1, Trinh Quoc Trong2
ABSTRACT
In this study, 4 strains of bacteria E. ictaluri, namely I, II, III and IV were isolated and characterized 
from 50 diseased fish samples collected from culture farms in Mekong Delta from March, 2010 to 
May, 2013. Through the challenge tests using those E. ictaluri strains, the same bacillary necrosis 
pathology was reproduced in experimental fish. Among 4 strains of E. ictaluri, strain I and II ap-
pear to be the most virulent with the LD
50 
is approximately 2x104 CFU/0.2 ml/fish which is double 
the LD
50
 of strain II and III. At the dose of 106 CFU/fish, the experimental fish started to die in the 
second day post injection with the E. ictaluri I caused more than 99% mortality. In the challenge test 
with the dose of 105 CFU/fish, majority of the fish died after 3 days post injection. The E. ictaluri I 
caused 85% mortality. At the lowest dose, 104 CFU/fish, after 4 days post injection, the fish started 
to die. The E. ictaluri IV induced mortality the most with more than 50% of mortality. Generally, 
the virulence of E. ictaluri strains causing bacillary necrosis pathology in trafish might vary but not 
significant.
Keywords: bacteria, challenge, injection.
Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015
Ngày duyệt đăng: 15/6/2015
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2. 
* Email: lehongphuoc@yahoo.com 
2 National Breeding Center for Southern Freshwater Aquaculture, Research Institute for Aquaculture No.2