Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất thảo dược lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamie) trong điều kiện in vitro

 tra gen độc lực gõy bệnh hoại tử gan
tụy cấp tớnh theo phương phỏp realtime PCR
bằng bộ kit của Cụng ty TNHH Cụng nghệ
Sinh học Khoa Thương tại Trung tõm Phõn
tớch – Kiểm nghiệm TVU, Trường Đại học
Trà Vinh.
3) Phương phỏp chiết xuất thảo dược:
Việc chiết xuất thảo dược dựa vào phương
phỏp của Nguyễn Văn Đàn và cộng sự [16].
Chiết xuất thảo dược bằng ethanol: Thảo
dược đem rửa sạch và phơi khụ (to ≤ 50oC).
Tiếp theo, thảo dược được xay nhuyễn và
ngõm ethanol 90%, 70% (tỉ lệ ethanol và
thảo dược là 4:1). Sau bảy ngày lọc qua giấy
lọc, chỳng tụi thu được cao chiết. Sau đú,
cao chiết được đem phơi đến khi khụ (to ≤
50oC). Cao chiết được bảo quản nơi thoỏng
mỏt 4oC.
Chiết xuất dịch tươi thảo dược: Thảo dược
tươi được rửa sạch và để rỏo nước. Tiếp theo,
thảo dược được xay nhuyễn với nước 1,5%
NaCl (tỉ lệ thảo dược và nước 1,5% NaCl là
1:1), sau đú, lọc lấy nước cốt. Dịch tươi được
bảo quản trong tủ mỏt 4oC khụng quỏ 24 giờ.
Hiệu suất (%) chiết xuất thảo dược được
dựa theo tiờu chuẩn Dược điển Việt Nam IV
[17]:
Hiệu suất (%) = [khối lượng chất chiết xuất
(g) / khối lượng mẫu cao chiết] * 100.
4) Phương phỏp xỏc định khả năng khỏng
khuẩn của thảo dược qua khuếch tỏn trờn
giếng thạch: Phục hồi vi khuẩn V. para-
haemolyticus gõy bệnh hoại tử gan tụy cấp
tớnh trong mụi trường BHIB cú bổ sung 1,5%
NaCl. Mật độ vi khuẩn sẽ được xỏc định
bằng mỏy đo quang phổ ở bước súng 610
nm. Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 CFU/mL,
chỳng ta lắc đều bỡnh chứa vi khuẩn, dựng
pipet hỳt 100 àL vi khuẩn nhỏ vào giữa đĩa
thạch mụi trường BHIA, dựng que thủy tinh
trải đều. Sau 15 phỳt tiến hành đục lỗ trờn
mặt thạch với đường kớnh 6 mm/lỗ đục cỏch
nhau khoảng 20 mm và khoảng cỏch giữa lỗ
với mộp đĩa petri 10-15 mm. Mỗi đĩa petri
(đường kớnh 100 mm) đục bốn lỗ.
Chỳng ta dựng pipet hỳt 100 àL chiết xuất
dịch tươi thảo dược nhỏ trực tiếp vào giếng
thạch. Thảo dược ethanol 90% và thảo dược
ethanol 70% được chiết xuất, đem pha loóng
84
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 38, THÁNG 6 NĂM 2020 NễNG NGHIỆP - THỦY SẢN
với nước 1,5% NaCl (tỉ lệ thảo dược và nước
1,5% NaCl là 1 : 10). Sau đú, chỳng ta hỳt
100 àL nhỏ vào giếng thạch (mỗi nghiệm
thức lặp lại ba lần), đặt đĩa thạch vào tủ ấm
ở điều kiện 37oC. Sau 24 giờ, chỳng ta tiến
hành đọc kết quả bằng cỏch đo đường kớnh
vũng vụ khuẩn [18]-[20].
5) Phương phỏp thử nghiệm nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC): Thảo dược được pha
loóng với 1,5% NaCl theo cỏc nồng độ
5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L, 40 mg/L, 80
mg/L. . . 163.840 mg/L. Vi khuẩn V. para-
haemolyticus được nuụi tăng sinh trong mụi
trường BHIB cú bổ sung 1,5% NaCL. Mật
độ vi khuẩn dung trong thớ nghiệm là 108
CFU/ mL, thớ nghiệm lặp lại ba lần. Sau 24
giờ, chỳng ta đọc và ghi nhận kết quả [16].
C. Phương phỏp xử lớ số liệu
Cỏc số liệu được xử lớ thống kờ sinh học
bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và
SPSS 18.
D. Kết quả chiết xuất thảo dược
Bảng 1: Kết quả hiệu suất chiết xuất ethanol
70% và ethanol 90% của thảo dược
Loại dịch chiết
Khối lượng
khụ (g)
Khối lượng
cao chiết (g)
Hiệu
suất (%)
Lỏ trứng cỏ
Ethanal 70% 200 38,24 19,12
Ethanal 90% 200 37,66 18,83
Hành tõy
Ethanal 70% 200 87,89 43,94
Ethanal 90% 200 66,86 33,43
Thự lự
Ethanal 70% 200 50,85 25,42
Ethanal 90% 200 46,82 23,41
(Nguồn: Tỏc giả tổng hợp)
Hiệu suất chiết xuất từ ethanol 70% cao
nhất là cao chiết hành tõy (43,94%), thấp nhất
là cao chiết lỏ trứng cỏ (19,12%). Đối với
chiết xuất từ ethanol 90%, hiệu suất cao nhất
ở hành tõy (33,43%) và thấp nhất ở lỏ trứng
cỏ (18,83%). Kết quả hiệu suất chiết xuất lỏ
trứng cỏ từ dung mụi ethanol cao hơn so với
hiệu suất chiết xuất lỏ trứng cỏ từ dung mụi
nước (11,928 %) của Puguh et al. [21] Kết
quả hiệu suất chiết xuất thự lự từ dung mụi
ethanol thấp hơn so với hiệu suất chiết xuất
thự lự từ dung mụi nước (29,44%) của Aina
et al. [22]. Kết quả hiệu suất chiết xuất hành
tõy từ dung mụi ethanol cao hơn so với hiệu
suất chiết xuất hành tõy từ dung mụi ethyl
acetate (1,64%) của Đỗ Thị Thanh Trung và
cộng sự [23]. Phương phỏp chiết xuất và dung
mụi khỏc nhau cho hiệu suất chiết xuất thu
được khỏc nhau. Nguyờn nhõn là do cỏc điều
kiện nhiệt độ, thời gian sấy mẫu, mẫu thu
hỏi những vựng khỏc nhau, thời gian thu hỏi
khỏc nhau, loại dung mụi. Cỏc điều kiện này
ảnh hưởng đến quỏ trỡnh chiết xuất, mức độ
phỏ vỡ mụ tế bào và giải phúng cỏc chất cú
trong thảo dược [24].
E. Hoạt tớnh khỏng khuẩn của thảo dược đối
với vi khuẩn V. parahaemolyticus gõy bệnh
hoại tử gan tụy cấp tớnh trờn tụm
Hỡnh 1: Khả năng ức chế vi khuẩn của hành
tõy
(Ghi chỳ: (1) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 90%; (2) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 70%; (3) dịch tươi: (4) đối chứng (-):
1,5% NaCl)
Kết quả thớ nghiệm ở Bảng 2 cho thấy cao
chiết lỏ trứng cỏ cú đường kớnh khỏng khuẩn
V. parahaemolyticus lớn hơn hành tõy và thự
lự, khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ (p < 0,05).
Chiết xuất lỏ trứng cỏ bằng ethanol 70%
cho kết quả cao nhất với đường kớnh khỏng
85
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 38, THÁNG 6 NĂM 2020 NễNG NGHIỆP - THỦY SẢN
Bảng 2: Khả năng khỏng khuẩn V. para-
haemolyticus của cỏc loại chiết xuất từ lỏ
trứng cỏ, hành tõy và thự lự
Loại thảo dược
Đường kớnh vũng vụ khuẩn
(mm)
Trứng cỏ
Ethanol 70% 18,00 ± 0,00c
Ethanol 90% 17,33 ± 0,58c
Dịch tươi 13,00 ± 0,00b
Hành tõy
Ethanol 70% 0 ± 0a
Ethanol 90% 0 ± 0a
Dịch tươi 0 ± 0a
Thự lự
Ethanol 70% 0 ± 0a
Ethanol 90% 0 ± 0a
Dịch tươi 0 ± 0a
Đối chứng (-): NaCl 1.5% 0
P 0
(Nguồn: Tỏc giả tổng hợp)
(Ghi chỳ: Cỏc giỏ trị trong bảng là trung bỡnh và
độ lệch chuẩn, cỏc giỏ trị trong cựng một cột cú
cỏc kớ tự khỏc nhau thỡ khỏc biệt cú ý nghĩa
thống kờ (p < 0,005))
Hỡnh 2: Khả năng ức chế vi khuẩn của
thự lự
(Ghi chỳ: (1) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 90%; (2) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 70%; (3) dịch tươi: (4) đối chứng (-):
1,5% NaCl)
Hỡnh 3: Khả năng ức chế vi khuẩn của lỏ
trứng cỏ
(Ghi chỳ: (1) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 90%; (2) thảo dược chiết xuất bằng
ethanol 70%; (3) dịch tươi: (4) đối chứng (-):
1,5% NaCl)
khuẩn lớn nhất đạt 18,00 ± 0,00 mm, tiếp
theo lần lượt là chiết xuất lỏ trứng cỏ ethanol
90% với vũng vụ khuẩn là 17,33 ± 0,58 mm
và dịch tươi là 13,00 ± 0,00 mm. Đường kớnh
vũng khỏng khuẩn của chiết xuất lỏ trứng cỏ
ethanol 70% khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ
so với dịch tươi nhưng khỏc biệt khụng cú
ý nghĩa thống kờ với chiết xuất lỏ trứng cỏ
ethanol 90% (p < 0,05).
Khả năng khỏng khuẩn V. parahaemolyti-
cus của chiết xuất lỏ trứng cỏ ethanol 70%
và ethanol 90% cú đường kớnh khỏng khuẩn
lớn hơn so với nghiờn cứu của Hồng Mộng
Huyền và cộng sự [13] đối với bảy loại chiết
xuất thảo dược: thầu dầu, lưỡi rắn, mật gấu,
chựm ngõy, lược vàng, ụ rụ và sài đất, vũng
khỏng khuẩn lần lượt như sau: 17,5 ± 0,7
mm, 7,0 ± 0,0 mm, 9,5 ± 0,7 mm 9,0 ± 0,0
mm, 7,5 ± 0,7 mm, 9,0 ± 1,4 mm và 8,0 ±
1,4 mm.
Lỏ trứng cỏ chứa hợp chất flavonoid, tanin,
saponin. Theo Cushine et al. [25], hầu hết cỏc
hợp chất flavonoid cú tỏc dụng khỏng khuẩn
do nú kỡm hóm và ngăn sự phõn chia của vi
khuẩn, ức chế enzym transpeptid, ngăn quỏ
trỡnh tổng hợp mucopeptid (yếu tố tạo nờn
sự bền vững thành vi khuẩn), khi hợp chất
flavonoid gắn lờn màng vi khuẩn làm thay
đổi tớnh thấm của màng, ức chế quỏ trỡnh
tổng hợp acid nucleic và RNA của vi khuẩn
86
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 38, THÁNG 6 NĂM 2020 NễNG NGHIỆP - THỦY SẢN
và ức chế sự hoạt động của hyaluronidase
(enzym giỳp cho vi khuẩn tấn cụng sang cỏc
tế bào lõn cận). Bờn cạnh đú, cỏc vũng carbon
sỏu cạnh cú gắn cỏc nhúm OH cũng gõy ảnh
hưởng đến thành tế bào vi khuẩn. Cỏc nhúm
hợp chất này sẽ xuyờn qua thành tế bào vi
khuẩn sau đú bỏm chặt vào những cấu trỳc
ở kớch thước phõn tử trong tế bào vi sinh vật
như protein và glycoprotein, điều này làm rối
loạn quỏ trỡnh sinh tổng hợp của cỏc vi sinh
vật đú gõy chết vi sinh vật [26].
F. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
chiết xuất thảo dược lờn vi khuẩn V. para-
haemolyticus gõy bệnh bệnh hoại tử gan tụy
cấp tớnh trờn tụm
Hỡnh 4: Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) của chiết xuất thảo dược
Kết quả thớ nghiệm với chiết xuất ethanol
70% giỏ trị MIC thấp nhất ở chiết xuất lỏ
trứng cỏ (5.120 mg/L) và cao nhất là chiết
xuất thự lự (81.920 mg/L). Chiết xuất ethanol
90% giỏ trị MIC thấp nhất ở chiết xuất lỏ
trứng cỏ (10.240 mg/L) và cao nhất là chiết
xuất thự lự (81.920 mg/L). Khả năng khỏng
khuẩn V. parahaemolyticus của chiết xuất lỏ
trứng cỏ cao hơn so với nghiờn cứu của Hồng
Mộng Huyền và cộng sự [13], nồng độ MIC
của cõy thầu dầu là 2,5 mg/mL. Ngoài ra,
nghiờn cứu cõy chú đẻ thõn xanh trờn vi
khuẩn V. parahaemolyticus gõy bệnh hoại tử
gan tụy cấp tớnh cho thấy: kết quả MIC là 125
mg/mL [27]. Cao chiết của cõy chú đẻ thõn
xanh đối với vi khuẩn V. parahaemoliticus
giỏ trị MIC bằng 312 mg/mL [28].
IV. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
Chiết xuất lỏ trứng cỏ ethanol 70% cú
đường kớnh vũng khỏng khuẩn lớn nhất đạt
18,00 ± 0,00 mm. Tiếp theo, chiết xuất lỏ
trứng cỏ ethanol 90% là 17,33 ± 0,58 mm
và chiết xuất dịch tươi là 13,00 ± 0,00 mm.
Giỏ trị MIC của chiết xuất lỏ trứng cỏ
ethanol 90%, chiết xuất lỏ trứng cỏ ethanol
70% lần lượt là 5.120 mg/L, 10.240 mg/L.
Chiết xuất hành tõy bằng ethanol 90%, 70%
là 40.960 mg/L. Chiết xuất thự lự ethanol
90%, 70% là 81.920 mg/L.
Thớ nghiệm nghiờn cứu thảo dược khỏng
V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro.
Do đú, chỳng ta cần nghiờn cứu gõy cảm
nhiễm và thăm dũ hiệu quả của chiết xuất lỏ
trứng cỏ khỏng khuẩn V. parahaemolyticus
gõy bệnh hoại tử gan tụy cấp tớnh trờn tụm
thẻ chõn trắng; xỏc định liều lượng thảo dược
hợp lớ đưa vào thức ăn trong quỏ trỡnh phũng
trị bệnh trong mụi trường thớ nghiệm và ngoài
thực địa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] VFS. Bỏo cỏo ngành Thủy sản. Phũng Nghiờn cứu
phõn tớch (Vietfirst Securitiest). Cụng ty Cổ phần
chứng khoỏn Nhất Việt. 2018.
[2] Bộ Nụng nghiệp và Phỏt triển nụng thụn. Sản xuất
thủy sản 10 thỏng đầu năm tăng 5,5%. Viện Kinh tế
và Quy hoạch thủy sản. 2019.
[3] Eduardo M. Leano, Mohan C.V., Early Mortality
Syndrome (EMS)/ Acute Hepatopancreatic Necrosis
Syndrome (AHPNS): An emrging threat in the Asian
shrimp industry NACA, Bangkok, ThaiLand. FAO
Fisheries and Aquaculture Report. 2012;1053:54.
[4] Panakorn S. Opinion article: more on early mortality
syndrome in the shrimp. Aquaculture Asia Pacific.
2012;8(1): 8-10.
[5] Cục Thống kờ Trà Vinh. Tỡnh hỡnh kinh tế - xó hội
tỉnh Trà Vinh quý I năm 2019. 2019.
[6] Tran L, Nunan L, Redman R M, Mohney L L, Pantoja
C. R, Fitzsimmons K, Lightner D V. Determination of
the infectious nature of the agent of acute hepatopan-
creatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp.
Dis. Aquat. 2013.
[7] Brown J. Antibiotics: their use and abuse in aquacul-
ture. World Aquac. 1989;20(2):34 - 43.
87
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 38, THÁNG 6 NĂM 2020 NễNG NGHIỆP - THỦY SẢN
[8] Cos P, Vlietinck A.J., Berghe D.V., Maes L. Anti-
infective potential of natural products: How to de-
velop a stronger in vitro ‘proof of concept’. Journal
of Ethnopharmacology. 2006;106(3):290 – 302.
[9] Mahesh B., Satish S. Antimicrobial activity of some
important medicinal plant against plant and human
pathogens. World Journal of Agricultural Sciences.
2008;4:839-843.
[10] Trị Thủy. Cỏc nghiờn cứu thảo mộc trong nuụi
trồng thủy sản. Truy cập từ: https://tepbac.com/tin-
tuc/full/Cac-nghien-cuu-thao-moc-trong-nuoi-trong-
thuy-san-22402.html [Ngày truy cập: 25/03/2020].
[11] Su Y. C., Liu C. Vibrio parahaemolyticus: a con-
cern of seafood safety. Food Microbiology. 2007; 24,
549e558. 75.
[12] Nguyễn Cụng Trỏng, Ngụ Thị Kim Cỳc, Phan Ngọc
Thịnh. Khả năng khỏng Vibrio parahaemolyticus của
dịch trớch cõy trõm bầu (Combretum quadrangulare)
trong điều kiện in vitro. Tạp chớ Khoa học Trường
Đại học An Giang. 2018;19(1):1-6.
[13] Hồng Mộng Huyền, Vừ Tấn Huy, Trần Thị Tuyết Hoa.
Hoạt tớnh khỏng khuẩn của một số cao chiết thảo dược
khỏng vi khuẩn gõy bệnh ở tụm nuụi. Tạp chớ Khoa
học Trường Đại học Cần Thơ. 2018;Số chuyờn đề:
Thủy sản(2):143-150.
[14] Angela Di Pinto, Valentina Terio, Lucia Nov-
ello, Giuseppina Tantillo. Comparison between
thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar
and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio para-
haemolyticus. Food Control xxx. 2010;1 e 4.
[15] Lờ Xuõn Phương. Thớ nghiệm vi sinh vật học. Hà Nội:
Nhà Xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội; 2008.
[16] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu. Phương phỏp
nghiờn cứu húa học cõy thuốc. Thành phố Hồ Chớ
Minh: Nhà Xuất bản Y học; 1985.
[17] Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. Hà Nội: Nhà Xuất
bản Y học Hà Nội; 2009; PL1.1.
[18] Marie B. Coyle. Manual of Antimicrobial Suscep-
tibility Testing. Library of Congress Cataloging-in-
Publication Data. 2005.
[19] Mary Jane Ferraro. Antimicrobial Susceptibility Test-
ing: A Review of General Principles and Contempo-
rary Practices. 2009;49(11):1749-1755.
[20] Schillinger V., Luke, K.K. Antibacterial activity of
Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ.
1989; 55:1091-1096.
[21] Puguh Surijowar, Sarwiyono, Imam Thohari, Aswah
Ridhowi. Quantitative and qualitative phytochemicals
analysis of Muntingia calabura. Ethnopharm. Ter-
nak Tropikat Journal of Tropical Animal Production.
2014;15(2):7-14.
[22] S.A. Aina, A.D. Banjo, O.A. Lawal, K. Jonathan. Ef-
ficacy of Some Plant Extracts on Anopheles gambiae
Mosquito Larvae. Academic Journal of Entomology
2. 2009;(1):31-35.
[23] Đỗ Thị Thanh Trung, Phạm Thị Vui, Nguyễn Huyền
Trang, Phạm Vinh Hoa, Nguyễn Thị Thanh Thi, Phạm
Thị Lương Hằng, Phạm Bảo Yờn. Đỏnh giỏ khả năng
ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori của một số dịch
chiết thảo dược Việt Nam. Tạp chớ Khoa học Cụng
nghệ Việt Nam. 2018;60(7):23-27.
[24] Lờ Phượng Hiệp. Khảo sỏt khả năng ức chế vi khuẩn
gõy bệnh mụn trứng cỏ Propionibacterium acnes của
cao chiết từ cõy Trứng cỏ (Muntingia calabura L)
[Khúa luận tốt nghiệp]. Trường Đại học Tõy Đụ;
2017.
[25] Cushnie, Andrew. Antimicrobial activity of flavonoid.
International Journal of Antimicrobial Agent.
2005;26:343-356.
[26] Immin P., Sinning C. H. and Meyer A. Drugs, their
targets and the nature and number of drug targets.
Drug Discovery. 2006;5:821-834.
[27] Trần Vinh Phương, Hoàng Thị Ngọc Hõn, Đặng
Thanh Long, Phạm Thị Hải Yến, Nguyễn Quang
Linh, 2019. Hoạt tớnh khỏng khuẩn của dịch chiết
từ cõy chú để thõn xanh (Phyllanthus amarus) đối
với vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus và Vibrio sp.
gõy bệnh hoại tử gan tụy cấp trờn tụm chõn trắng
(Litopenaeus vannamei). Tạp chớ Khoa học Đại học
Huế: Khoa học Tự nhiờn. 2019;128(1E):99-106.
[28] Hai Thanh Nguyen, Lua T.Dang, Hanh Thi Nguyen,
Hai Ha Hoang, Ha Thi Ngoc Lai, Ha Thi Thanh
Nguyen. Screening antibacterial effects of Viet-
namese plant extracts against pathogens caused acute
hepatopancreatic necrosis disease in shrimps. Asian
Journal of Pharmaceutical and Clinical Research.
2018;11(5):77.
88