Xác định sự có mặt của các gen độc tố ở các chủng Vibrio gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng tại Thừa Thiên Huế

n bền 
nhiệt và tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt. Cả 
hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vp-
toxRS, được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo 
tồn cao trong loài [8]. 
Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một 
số kết quả bước đầu về sự có mặt của các gen độc 
tố trên các loài Vibrio gây bệnh trên tôm được phân 
lập ở Thừa Thiên Huế. 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1A, 115–123, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1A.5621 117 
2 Nguyên liệu và phương pháp 
2.1 Nguyên liệu 
Nguyên liệu nghiên cứu là các loài Vibrio 
phân lập từ mẫu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp 
tại tỉnh Thừa Thiên Huế do Viện Công nghệ sinh 
học, Đại học Huế cung cấp. Đây là các chủng đã 
được định danh và mang các gen độc tố pirAvp và 
pirBvp. 
2.2 Phương pháp 
Tách chiết DNA tổng số 
Các chủng vi khuẩn Vibrio được nuôi trong 
môi trường peptone muối kiềm (ASPW) với 2% 
peptone và 2% NaCl, pH 8,6, lắc trong 18 giờ ở 30 
°C với tốc độ 180 vòng/phút. Dịch nuôi cấy được ly 
tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút ở 4 °C để thu tế 
bào. DNA tổng số được tách chiết bằng AquaPure 
Genomic DNA Isolation Kit (Cat. 732-6340, Bio-
rad) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó 
bảo quản ở 4 °C. Chất lượng DNA tổng số được 
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. 
Xác định sự có mặt của gen mã hóa độc tố của vi 
khuẩn 
Sự có mặt của độc tố của các chủng gây bệnh 
gan tụy cấp trên tôm được xác định thông qua sự 
có mặt của các gen mã hóa protein độc tính (pirAvp, 
pirBvp, toxR và tlh) dựa trên các cặp mồi đặc hiệu 
cho đoạn chỉ thị của các gen này. Trình tự cụ thể 
các mồi được trình bày ở Bảng 1. 
Thành phần PCR bao gồm: 50 ng DNA tổng 
số, 10 pmol primer mỗi loại, 6 µL 2× GoTaq® Green 
Master Mix (Promega, Mỹ), bổ sung nước cất vô 
trùng vừa đủ 12 µL. Quá trình khuếch đại PCR 
được thực hiện trong máy luân nhiệt MJ Mini™ 
Thermal Cycler (Biorad, Mỹ) theo chu trình: 95 
°C/10 phút; 30 chu kỳ: 95 °C/30 giây, 53 °C/30 giây, 
và 72 °C/1 phút; cuối cùng 72 °C/10 phút. Sản phẩm 
PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm 
bằng 6× GelRedTM loading buffer with tricolor 
(ABT, Việt Nam). Hình ảnh điện di được thu nhận 
trên bàn đọc UV. 
Sản phẩm PCR được tạo dòng vào vector 
pGEM T-easy (Promega) theo hướng dẫn của nhà 
sản xuất, sau đó các vector tái tổ hợp được chuyển 
vào vi khuẩn E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc 
nhiệt. Thể tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường 
LB có bổ sung 50 µg/mL ampicillin, X-Gal/IPTG. 
Khuẩn lạc màu trắng được chọn ngẫu nhiên từ các 
đĩa và tiến hành PCR với cặp mồi M13F (5’-
GTAAACGACGGCCAG-3’) và M13R (5’-CAGGA 
AACAGCTATG AC-3’). Chu trình nhiệt của phản 
ứng khuếch đại với mồi M13 được thực hiện giống 
như phần trên. Sản phẩm PCR được điện di kiểm 
tra trên gel agarose 0,8% và được gửi đi phân tích 
trình tự tự bằng phương pháp Sanger. 
Trình tự nucleotide của các gen được kiểm 
tra bằng phần mềm BioEdit, sau đó so sánh với các 
trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen thông 
qua công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih. 
gov/). 
Bảng 1. Trình tự các mồi sử dụng 
Gen Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thước (bp) Tài liệu tham khảo 
pirAvp VpPirA-284 5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG-3’ 
5’-CACGACTAGCGCCATTGTTA-3’ 
284 [4] 
pirBvp VpPirB-392 5’-TGATGAAGTGATGGGTGCTC-3’ 
5’-TGTAAGCGCCGTTTAACTCA-3’ 
392 [4] 
tlh tl 5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’ 
5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’ 
450 [9] 
toxR tR 5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’ 367 [10] 
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
118 
Gen Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thước (bp) Tài liệu tham khảo 
5’-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ 
trh L-trh 
R-trh 
5’-TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT-3’ 
5’-CATAACAAACATATGCCCATTTCCG-3’ 
410 [11] 
tdh L-tdh 
R-tdh 
5’-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3’ 
5’-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3’ 
245 [11] 
3 Kết quả và thảo luận 
3.1 Sự có mặt của các gen độc tố trên các chủng 
Vibrio gây bệnh 
Dựa trên các chủng Vibrio được cung cấp, 
chúng tôi đã nuôi cấy tăng sinh trên môi trường 
ASPW, tách chiết DNA tổng số sau đó xác định sự 
có mặt của các gen độc tố. Từ 14 chủng mang gen 
gây bệnh là pirAvp và pirBvp, chúng tôi tiến hành 
khảo sát sự có mặt của các gen độc tố khác là tlh, 
toxR, trh và tdh. 
Kết quả khảo sát sự có mặt của gen tlh cho 
thấy 100% chủng mang gen này, đây là tỷ lệ phù 
hợp với các công bố trước đây. Đối với gen toxR, 
chúng tôi ghi nhận 7/14 mẫu chứa gen này, trong 
đó toàn bộ thuộc về loài V. parahaemolyticus (Bảng 
2). Theo Han và cs., gen tlh và toxR xuất hiện ở 
100% các loài V. parahaemolyticus nghiên cứu [4]; 
điều này tương đồng với kết quả nghiên cứu của 
chúng tôi. Trong khi đó, Gutierrez West và cs. 
nghiên cứu trên các chủng V. parahaemolyticus phân 
lập từ vùng cửa sông ở Mỹ nhận thấy 79% số chủng 
mang gen tlh [11]. Ở Việt Nam, sự có mặt của 2 gen 
tlh và toxR trên các chủng Vibrio gây bệnh cũng đã 
được công bố. Nguyễn Văn Duy và Nguyễn Thị 
Cẩm Ly đã phân lập được 5 chủng V. 
parahaemolyticus trong mẫu hải sản tươi sống ở Nha 
Trang và cả 5 chủng này đều mang cả 2 gen tlh và 
toxR [12]. Tương tự, nghiên cứu của Han và cs. cho 
thấy 9/9 chủng V. parahaemolyticus ở Việt Nam 
mang cả 2 gen tlh và toxR [13]. 
Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi cũng 
nhận thấy 2 gen trh và tdh không xuất hiện ở các 
mẫu nghiên cứu. Kết quả này cũng tương đồng với 
kết quả của Nguyễn Văn Duy và Nguyễn Thị Cẩm 
Ly trên loài V. parahaemolyticus trong mẫu hải sản 
tươi sống ở Nha Trang. Kết quả nghiên cứu của 
chúng tôi cho thấy có sự tương đồng nhất định 
giữa các chủng Vibrio gây bệnh ở Việt Nam. Các 
chủng thu được ở Thừa Thiên Huế có sự có mặt 
của các gen độc tố tương tự như các chủng thu 
được tại Nha Trang [12]. Các công bố trước đây cho 
thấy không phải chủng Vibrio nào cũng mang tất cả 
các gen độc tố, chẳng hạn, Mahmud và cs. nhận 
thấy chỉ có 18/6000 chủng V. parahaemolyticus ở 
Nhật Bản chứa gen tdh [9]. 
Bảng 2. Sự có mặt của các gen độc tố trong các chủng 
Vibrio gây bệnh 
TT Loài tlh toxR trh tdh 
1 V. parahaemolyticus 
TX07-3/3 
x x – – 
2 V. shilonii TX05-3/3 x – – – 
3 V. shilonii TX03-3/3 x – – – 
4 V. shilonii TX02-3/3 x – – – 
5 V. shilonii TX01-3/3 x – – – 
6 V. shilonii TV02-3/3 x – – – 
7 V. parahaemolyticus 
K31-X-13/6/2019 
x x – – 
8 V. parahaemolyticus 
K39-X-13/6 
x x – – 
9 V. communis R-PD-
K4-V-13/6 
x – – – 
10 V. parahaemolyticus 
R-PD-K3-10/6 
x x – – 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1A, 115–123, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1A.5621 119 
TT Loài tlh toxR trh tdh 
11 V. parahaemolyticus 
R-PD-K3-10/6 
x x – – 
12 V. furnissii R-K39-
13/6 
x – – – 
13 V. parahaemolyticus 
VX01 
x x – – 
14 V. parahaemolyticus 
K5 
x x – – 
3.2 Xác định trình tự của các gen độc tố 
Sau khi xác định được các chủng mang gen 
gây bệnh, chúng tôi chọn các gen từ chủng VX01 
để phân tích trình tự các gen độc tố. Đây là chủng 
đầu tiên được phân lập trong các chủng mang gen 
pirABvr (Hình 1). Kết quả phân tích trình tự cho thấy 
cả 4 gen nghiên cứu đều có trình tự tương đồng 
100% với các gen tương ứng của loài V. 
parahaemolyticus đã được công bố trên ngân hàng 
gen. 
Đối với gen pirAvp, kết quả phân tích trình tự 
sản phẩm PCR cho thấy trình tự nucleotide của nó 
dài 284 bp (Hình 2), đúng bằng kích thước lý 
thuyết đã công bố và tương đồng 100% với trình tự 
gen pirA của chủng V. parahaemolyticus CMCR003, 
mã số MH700243. Kết quả so sánh cũng cho thấy 
có ít sự sai khác giữa các gen pirA đã công bố từ các 
chủng Vibrio trên ngân hàng gen. Hai mươi chín 
trình tự đã công bố tương đồng 100% với trình tự 
chúng tôi thu được. 
Hình 1. Sản phẩm PCR các gen độc tố từ chủng V. 
parahaemolyticus VX01 
M: DNA ladder 1 Kb marker
Hình 2. Trình tự nucleotide đoạn chỉ thị gen pirAvp và trình tự đã công bố (MH700243) 
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
120 
Đối với gen pirB, kết quả phân tích trình tự 
sản phẩm PCR cho thấy trình tự nucleotide của nó 
dài 392 bp (Hình 3) đúng như lý thuyết đã công bố 
và tương đồng 100% với trình tự gen pirB của 
chủng V. parahaemolyticus RECR004, mã số 
MH714301. Tương tự gen pirAvp, 27 trình tự gen 
pirB từ các chủng Vibrio đã công bố tương đồng 
100% với trình tự của chúng tôi. 
 Đối với gen tlh, kết quả phân tích trình tự sản 
phẩm PCR cho thấy trình tự nucleotide của nó dài 
450 bp (Hình 4) giống như lý thuyết, tương đồng 
100% với trình tự gen tlh của chủng V. 
parahaemolyticus ATCC 33846 (mã số GU971655). 
Tuy nhiên, khi so sánh trình tự thu được với gen 
tlh của chủng V. parahaemolyticus TS-9-11-1 (mã số 
JX262963), mức độ tương đồng là 99,78% (sai khác 
1 nucleotide ở vị trí 347). So sánh với gen tlh của 
chủng V. parahaemolyticus HA2 (mã số CP023709), 
mức độ tương đồng là 99,56% (sai khác 2 
nucleotide ở vị trí 6 và 259). Kết quả so sánh với 100 
trình tự tương đồng cao nhất trên NCBI cho thấy 
mức độ tương đồng của gen tlh với các gen đã công 
bố thấp hơn so với gen pirAvp và pirBvp, trong đó chỉ 
có 5 trình tự tương đồng 100%. Điều này chứng tỏ 
gen tlh là gen có mức độ đột biến cao và không ổn 
định như gen pirA và pirB. So sánh với gen tlh từ 
chủng V. parahaemolyticus strain C1 phân lập ở Nha 
Trang (mã số JQ929914) [12], gen tlh của chúng tôi 
có mức độ tương đồng 99,56% (sai khác 2 
nucleotide ở vị trí 255 và 426). Như vậy, có thể thấy 
gen tlh ở Việt Nam có sự khác nhau giữa các vùng.
Hình 3. Trình tự nucleotide đoạn chỉ thị gen pirBvp và trình tự đã công bố (MH714301) 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1A, 115–123, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1A.5621 121 
Hình 4. Trình tự nucleotide đoạn chỉ thị gen tlh và trình tự đã công bố (JQ929914) 
Đối với gen toxR, kết quả phân tích cho thấy 
trình tự nucleotide của sản phẩm PCR dài 367 bp 
(Hình 5) và tương đồng 100% với trình tự gen toxR 
của chủng V. parahaemolyticus 20130629002S01 (mã 
số CP020034). So sánh với gen toxR từ chủng V. 
parahaemolyticus strain C1 phân lập ở Nha Trang 
(mã số JQ929913), gen toxR của chúng tôi có mức 
độ tương đồng 100% [12]. Như vậy có thể thấy gen 
toxR ở Việt Nam không có sự sai khác giữa các 
vùng. 
Tuy nhiên, khi so sánh trình tự thu được với 
gen toxR của chủng V. parahaemolyticus NSTH10 
(mã số KF993361), mức độ tương đồng là 99,73% 
(sai khác 1 nucleotide ở vị trí 76). So sánh với gen 
toxR của chủng V. parahaemolyticus D3112 (mã số 
CP034565), mức độ tương đồng là 99,45% (sai khác 
2 nucleotide ở vị trí 286 và 301). Khi so sánh trình 
tự của chúng tôi với 100 gen toxR của các chủng 
Vibrio khác có mức độ tương đồng cao nhất đã công 
bố trên ngân hàng gen, chỉ có 7 trình tự có độ tương 
đồng 100%. Tương tự như gen tlh, gen toxR là một 
gen có mức độ đột biến cao và không ổn định như 
gen pirA và pirB.
Hoàng Tấn Quảng và CS. 
122 
Hình 5. Trình tự nucleotide đoạn chỉ thị gen toxR và trình tự đã công bố (CP034565)
4 Kết luận 
Từ 14 chủng Vibrio mang gen pirABvp nghiên 
cứu, chúng tôi nhận thấy gen tlh xuất hiện ở tất cả 
các chủng; gen toxR xuất hiện ở 7/14 chủng trong 
khi các gen trh và tdh không xuất hiện trong các 
chủng nghiên cứu. Giải trình tự đoạn chỉ thị các 
gen độc tố cho thấy các gen này đều có độ tương 
đồng khá cao (98–100%) so với các gen đã công bố 
trên ngân hàng gen, trong đó 2 gen pirAvp và pirBvp 
ít sai khác còn các gen tlh và toxR có sự sai khác 
nhiều hơn. 
Thông tin tài trợ: Công trình được thực hiện 
bằng kinh phí của các đề tài cấp Bộ Giáo dục và 
Đào tạo năm 2018–2020, mã số CT-2018-DHH-01 
và CT-2018-DHH-02. 
Tài liệu tham khảo 
1. de la Pena LD, Cabillon NA, Catedral DD, Amar EC, 
Usero RC, Monotilla WD, et al. Acute 
hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) 
outbreaks in Penaeus vannamei and P. monodon 
cultured in the Philippines. Dis Aquat Organ. 
2015;116(3):251-254. 
2. Giang NTT, Toàn PV, Hùng PQ. Hội chứng hoại tử 
gan tụy ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi 
thương phẩm tại Ninh Thuận. Tạp chí Khoa học – 
Công nghệ Thủy sản. 2016; 1:32-40. 
3. Lụa ĐT, Khuê NV, Vân PT. Non-Vibrio 
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp 
(AHPND) trên tôm nuôi. Tạp chí Khoa học Nông 
nghiệp Việt Nam. 2016;14(5):690-698. 
4. Han JE, Tang KFJ, Tran LH, Lightner DV. 
Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in 
a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative 
agent of acute hepatopancreatic necrosis disease 
(AHPND) of shrimp. Diseases of Aquatic 
Organisms. 2015;113(1):33-40. 
5. Lee CT, Chen IT, Yang YT, Ko TP, Huang YT, Huang 
JY, et al. The opportunistic marine pathogen Vibrio 
parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a 
plasmid that expresses a deadly toxin. Proceedings of 
the National Academy of Sciences. 2015;112(34):10798. 
6. Sirikharin R, Taengchaiyaphum S, Sanguanrut P, Chi 
TD, Mavichak R, Proespraiwong P, et al. 
Characterization and PCR detection of binary, Pir-like 
toxins from Vibrio parahaemolyticus Isolates that cause 
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in 
shrimp. PLOS ONE. 2015;10(5): e0126987. 
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 
Tập 129, Số 1A, 115–123, 2020 
pISSN 1859-1388 
eISSN 2615-9678 
DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1A.5621 123 
7. Yang YT, Chen IT, Lee CT, Chen CY, Lin SS, Hor LI, 
et al. Draft genome sequences of four strains of 
Vibrio parahaemolyticus, three of which cause early 
mortality syndrome/Acute Hepatopancreatic 
Necrosis Disease in shrimp in China and Thailand. 
Genome Announc. 2014;2(5):e00816-14. 
8. Nishibuchi M, Kaper JB. Thermostable direct 
hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a 
virulence gene acquired by a marine bacterium. 
Infect Immun. 1995;63(6):2093-2099. 
9. Mahmud HZ, Kassu A, Mohammad A, Yamato M, 
Bhuiyan NA, Balakrish Nair G, et al. Isolation and 
molecular characterization of toxigenic Vibrio 
parahaemolyticus from the Kii Channel, Japan. 
Microbiological Research. 2006;161(1):25-37. 
10. Kim YB, Okuda J, Matsumoto C, Takahashi N, 
Hashimoto S, Nishibuchi M. Identification of Vibrio 
parahaemolyticus strains at the species level by PCR 
targeted to the toxR gene. Journal of Clinical 
Microbiology. 1999;37(4):1173-1177. 
11. Gutierrez West CK, Klein SL, Lovell CR. High 
frequency of virulence factor genes tdh, trh, and tlh 
in Vibrio parahaemolyticus strains isolated from a 
pristine estuary. Applied and Environmental 
Microbiology. 2013;79(7):2247-2252. 
12. Duy NV, Ly NTC. Phân lập và xác định gen độc tố 
của Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống ở 
Nha Trang. Tạp chí Khoa học-Công nghệ thủy sản. 
2012;2:42-47. 
13. Han JE, Mohney LL, Tang KFJ, Pantoja CR, Lightner 
DV. Plasmid mediated tetracycline resistance of 
Vibrio parahaemolyticus associated with acute 
hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in 
shrimps. Aquaculture Reports. 2015;2:17-21.