Xác định một số nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) trong quá trình ấp bằng phương pháp PCR và SEM

n là thành phần chính nhân 
bản vùng gene phản ứng PCR bao gồm; Taq 
DNA polymerase, mồi ITS1F, mồi ITS4R, 
bộ gene DNA của cá Bá Chủ. Khuếch đại 
vùng gene ITS được thực hiện với 2 cặp mồi 
ITS1-F (M.Gardes, 1993) và ITS4 (T. J White, 
1990) cho nhóm vi nấm có trình tự ITS1F 
5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ và 
ITS4R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). 
Chu trình phản ứng PCR 98oC trong 3 phút, 
35 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 55oC trong 50 
giây, 72oC trong 1giây) và chu kỳ 72oC kéo dài 
10 phút Sau khi PCR, kết quả sản phẩm nhân 
bản đoạn gene ITS sẽ được kiểm tra trên gel 
agarose 1%, với nguồn điện 100 vol trong thời 
gian 45 phút với thang 100bp (hãng Thermo). 
Sau cùng nhuộm gel với Ethidium Bromide 
trong 15 phút và xem kết quả sản phẩm PCR 
dưới UV.
2.2.4. Giải trình tự và định danh nấm sợi
Sản phẩm giải trình tự gene được thực hiện 
bởi công ty Nam Khoa, Thành phố Hồ Chí 
Minh.
Kết quả giải trình tự được phân tích và 
thiết lập cây phát sinh loài bằng các phần mềm 
ChromasPro, MEGA 5, Seaview 4 và Ngân 
hàng gene NCBI.
2.2.5. Cảm nhiễm 
Phương pháp nuôi cấy để thu bào tử: 
nấm được nuôi cấy trong môi trường Peptone 
Yeast extract Glucose Salt Agar (PYGSA) gồm 
0,125% Bacto peptone; 0,125% Bacto yeast 
extract; 0,3% glucose; 1,2% agar và 3,8% 
muối); thời gian nuôi cấy là 7-10 ngày tùy vào 
tốc độ phát triển của từng loài nấm; ủ ở nhiệt độ 
25°C. Thu hoạch bào tử nấm bằng cách cho 10 
ml nước muối sinh lí (0,85% NaCl) đã tiệt trùng 
vào đĩa petri nuôi cấy nấm, dùng que cấy cào 
nhẹ trên bề mặt của đĩa thạch để cho các bào tử 
tách ra từ các khuẩn ty. Sau đó dung dịch này 
được lọc qua phễu lọc đã tiệt trùng (phễu bằng 
thủy tinh có lót 2 lớp vải mùng dùng trong y 
khoa) để thu bào tử. Số lượng bào tử nấm được 
xác định bằng cách sử dụng buồng đếm hồng 
cầu, xác định mật độ là 5x106 bào tử/ml dùng 
cho thí nghiệm gây cảm nhiễm. 
Trứng được thu từ miệng cá đực (P. 
kauderni) sau khi cá cái đẻ và được thụ tinh 
được 3 giờ. Sau khi trứng được kiểm tra không 
nhiễm nấm, tiến hành bố trí thí nghiệm cảm 
nhiễm với 3 chủng nấm đã phân lập (M1.1, M1 
và M4.1) bằng phương pháp ngâm với bào tử 
có mật độ 5x105 bào tử/ml. Sau thời gian ngâm 
7 ngày, tiến hành thu mẫu kiểm tra khả năng 
nhiễm của 3 chủng nấm trên bằng phương 
pháp SEM.
2.2.6. Phân tích hình ảnh tái nhiễm bằng kỹ 
thuật hình ảnh SEM
Hình ảnh SEM được chụp tại Viện Công 
nghệ Hóa học. 
III. KẾT QUẢ 
3.1. Hình thái của mẫu trứng cá Bá Chủ 
Kết quả hình ảnh trứng cá Bá Chủ phát triển 
bình thường có màu đỏ cam (Hình 1A) sau khi 
nhiễm bệnh trứng chuyển sang màu trắng đục 
(Hình 1B và 1C) trứng dai và cứng hơn so với 
trứng phát triển bình thường.
61TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.2. Kết quả hình thái học các nấm gây 
hỏng trứng cá Bá Chủ
Từ 4 mẫu trứng bị hỏng trong quá trình 
ấp trứng tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy 
sản II, đã được phân lập, làm thuần và chọn lọc 
được 3 chủng nấm bệnh kí hiệu là M1.1, M1 và 
M4.1 (Hình 2). 
Hình 1. Hình ảnh mẫu trứng cá Bá Chủ, A: Mẫu trứng cá chưa bị nhiễm, B: Mẫu trứng cá nhiễm một 
phần và C: mẫu trứng cá bị nhiễm hoàn toàn. Độ phóng đại ảnh 20X. 
Hình 2. Hình ảnh mẫu nấm bệnh của chủng M1.1, M1 và M4.1 trên môi trường PDA trong 48 giờ và 
sợi khuẩn ty và bào tử dưới vật kính 40X.
62 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Chủng nấm M1.1 được nuôi trên môi 
trường PDA ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 
48 giờ có kích thước khuẩn lạc là 20 – 24 mm, 
sợi nấm màu trắng, mặt trên màu trắng ở giữa 
màu vàng nhạt, mặt dưới có màu vàng cam, 
hơi hồng, rìa khuẩn lạc có dạng răng cưa. Dựa 
vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty cho 
thấy sợi có dạng phân nhánh, hình thành vách 
ngăn và tạo tế bào phân đốt, cuống bào tử đính 
hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi cong 
với một tế bào đỉnh nhọn và một tế bào hình 
chân thể bình đơn. Kết hợp với hình thái khuẩn 
lạc cho phép kết luận sơ bộ về chủng M1.1 có 
thể thuộc chi Fusarium (dựa vào hệ thống phân 
loại nấm của CBS Course of Mycology).
Tương tự với chủng nấm M1 cho thấy kích 
thước khuẩn lạc là 12 – 15 mm, sợi nấm màu 
trắng dạng mặt nhung mịn, mặt trên màu trắng, 
mặt dưới ở giữa màu hơi vàng, mép mỏng. 
Chủng M1 cũng có dạng sợi phân nhánh và có 
sự hình thành vách ngăn và tạo tế bào phân đốt. 
Kết hợp với hình thái khuẩn lạc cho phép kết 
luận sơ bộ về chủng M1 có thể thuộc vào chi 
Lecanicillium.
Còn chủng nấm M4.1 phát triển nhanh và 
mọc tràn khắp đĩa peptri, khuẩn lạc không có 
hình dạng rõ rệt, màu trắng tơi như bông gòn. 
Sau 48 giờ, chủng M4.1 sinh bào tử có màu 
vàng cam. Kết hợp với hình thái khuẩn lạc 
cho phép kết luận sơ bộ về chủng M4.1 có thể 
thuộc vào chi Neurospora (Amita Pandey, et 
al., 2004). 
3.3. Kết quả thu nhận bộ gene và sản 
phầm PCR của vùng gene ITS
Sau khảo sát hình thái học, tiếp tục li trích 
và thu nhận bộ gene DNA theo phương pháp 
CTAB rồi nhân bản đoạn gene ITS trên cặp 
mồi ITS1-F và ITS4-R, có kết quả sản phẩm 
trên gel agarose 1% ở Hình 3 với kích thước 
trong khoảng 500bp. 
Hình 3. Kết quả thu nhận bộ gene (A) và (B) sản phẩm PCR của gene ITS của chủng nấm 
M1.1. M1 và M4.1 trên gel agarose 1% và thang 100bp (hãng Thermo).
Từ kết quả sản phẩm nhân bản vùng gene 
ITS, các mẫu DNA được gởi giải trình tự gene 
tại công ty Nam Khoa, sau đó các trình tự gene 
được sử dụng các phần mềm sinh học phân tử 
(ChromasPro, MEGA 5) và BLAST các dữ liệu 
gene khác có trên ngân hàng gene NCBI. Kết 
quả thu được cây phát sinh loài (Seaview 4) 
(Hình 4).
63TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Tiến hành so sánh vùng gene của các mẫu 
phân lập được với vùng gene bảo tồn ITS của 
các chủng nấm sợi trên ngân hàng gene NCBI, 
các đặc điểm hình thái học của các chủng tương 
đồng và có được kết quả như sau.
Chủng M1.1 có mối quan hệ gần nhất 
với loài Fusarium incarnatum KM519192.1, 
Penicillium expansum FJ008994.1 và Fusarium 
longipes AB820724.1 có mức độ tương đồng 
của trình tự vùng gene chủng M1.1 và 3 chủng 
trên đều là 100%. 
Chủng M1 có mối quan hệ gần nhất với 
loài Lecanicillium fusisporum KF766521.1 
và Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với 
mức độ tương đồng là 100%. Kết quả so sánh 
trình tự gene giống nhau trên và các nghiên 
cứu về đặc điểm hình thái thì chủng M1 là loài 
Lecanicillium tenuipes. 
Chủng M4.1 có mối quan hệ gần nhất 
với loài Neurospora Crassa FJ360521.1, 
Neurospora pannonica KF881757.1 và 
Neurospora tetrasperma FJ904922.1 với mức 
độ gene tương đồng là 99%. Kết quả so sánh 
trình tự gene là 99% trình tự DNA giống nhau 
với 3 chủng trên và kết hợp đặc điểm hình thái 
thì chủng M4.1 là chủng Neurospora crassa. 
Để kiểm chứng sự hiện diện và nguyên 
nhân gây nhiễm nấm trong trứng của chủng nấm 
M1, M1.1 và M1.4 trong quá trình ấp trứng cá 
Bá Chủ. Mẫu trứng cá Bá Chủ được cảm nhiễm 
theo phương pháp Koch (Koch, R. 1876) với 3 
chủng trên từ hình ảnh SEM.
Hình 4. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene ITS chủng được phân M1, M1.1 và 
M4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gene NCBI.
64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.4. Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM của bề mặt mẫu trứng cá Bá Chủ
Kết quả hình ảnh bề mặt của trứng cá Bá Chủ được chụp qua kĩ thuật SEM xem Hình 5.
Hình 5. Hình ảnh SEM bề mặt của trứng cá Bá Chủ với 100X (a) và 500x (b).
Hình 6. Hình ảnh SEM của bề mặt của trứng cá Bá Chủ với 500X (a) và 1.000X (b) của mẫu nhiễm 
chủng nấm M4.1. Mẫu chủng M1(c) với độ phân giải là 1.000x và chủng M1.1 (d) với độ phân giải 
là 1.000X.
Từ kết quả ban đầu phân lập được 3 chủng 
nấm M1., M1.1 và M4.1 trong các mẫu sản 
phẩm trứng bị hỏng tiếp tục kiểm tra nguyên 
nhân gây hỏng thực sự bằng thí nghiệm cảm 
nhiễm theo phương pháp Koch cho thấy chỉ có 
chủng nấm M1.4 có thể gây hỏng trứng và có 
65TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
khả năng xâm nhiễm vào bên trong trứng thông 
qua hình ảnh SEM trên bề mặt trứng và bên 
trong trứng xem Hình 6. 
IV. THẢO LUẬN 
Theo kết quả so sánh trình tự gene và đặc 
điểm hình thái thì chủng M1.1 là loài Fusarium 
incarnatum. Chủng F. incarnatum được phân lập 
từ tổn thương mang của tôm sú nuôi (Penaeus 
monodon), mỗi vụ thu hoạch trong thời gian 
2000 - 2002 tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Tôm 
bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình của 
bệnh mang đen và tỷ lệ chết khoảng một tháng 
trước khi thu hoạch (Khoa và ctv., 2004). Chủng 
L. tenuipes được phân lập từ 0,82% xác B. 
piniaria được tìm thấy trong đất và được phân 
loại như là một nấm Keratinophylic. Nó có thể 
được kết hợp với côn trùng hoặc tuyến trùng 
trong đất (Dalė Pečiulytė và ctv., 2010).
Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm 
chủng M1, M1.1 và M4.1 cho thấy sự thay đổi 
từ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với 
độ phân giải 500X (Hình 6a) và vùng nhiễm 
nấm với độ phân giải 1000X (Hình 6b) so sánh 
với bề mặt trứng mẫu không nhiễm của chủng 
M1 (Hình 6c) và chủng M1.1 (Hình 6d) trong 
thời gian cảm nhiễm trong 3 ngày. Từ hình ảnh 
SEM và kết quả hình ảnh cảm nhiễm cho kết 
luận rằng chủng M4.1 (Neurospora crassa) là 
nấm có khả năng gây nhiễm và làm hỏng trứng 
cá Bá Chủ trong giai đoạn ấp trứng so với chủng 
M1 và M1.1. 
KẾT LUẬN
Qua chọn lọc sơ bộ từ 4 mẫu trứng cá bị 
hỏng thu được kết quả 3 mẫu nấm trên trứng 
cá Bá Chủ là M1.1, M1 và M4.1. Kết quả hình 
thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho 
thấy rằng chủng M1.1 có khả năng thuộc chi 
Fusarium, chủng M1 thuộc chi Lecanicillium và 
chủng M4.1 thuộc chi Neurospora.
Dựa vào kết quả thu nhận bộ gene DNA và 
nhân bản vùng bảo tồn ITS của 3 chủng M1.1, 
M1 và M4.1cùng với so sánh các dữ liệu gene 
của các chủng trên ngân hàng gene NCBI cho 
kết quả chủng M1.1 có mức độ tương đồng với 
loài Fusarium incarnatum là 100%, chủng M1 
có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium 
tenuipes là 100% và tương tự chủng M4.1 với 
loài Neurospora crassa là 99%.
Kết quả cảm nhiễm của 3 chủng nấm với 
trứng cá Bá Chủ từ những hình ảnh bằng kĩ 
thuật SEM cho thấy rằng chủng Neurospora 
crassa có khả năng xâm nhiễm vào trứng cá Bá 
Chủ gây hỏng trứng trong quá trình ấp. 
LỜI CẢM ƠN
Có được những kết quả trong nghiên cứu 
này, tôi xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học 
và Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, các anh 
chị đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng 
Thủy sản II và Phòng Vi sinh, Viện Sinh học 
Nhiệt đới đã hỗ trợ. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Tài liệu tiếng Việt
Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề và 
Đỗ Thị Muội, 2004. Giáo trình Bệnh học thủy 
sản. Đại họcThủy sản Nha Trang, 2004, NXB 
Nông Nghiệp.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 
2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Đại học 
Cần Thơ. Trang 73.
Tài liệu tiếng Anh
Pandey A., M. Gabriela Roca, Nick D. Read and 
N. Louise Glass, 2004. Role of a mitogen-
activated protein kinase pathway during conidial 
germination and hyphal fusion in Newrospora 
crassa. American society for Microbiology. 
doi: 10.1128/EC.3.2.348-358.2004. 
Cites, 2007. Convention on international trade 
in endangered species of wild fauna và flora. 
Fourteenth meeting of the Conference of the 
Parties The Hague (N etherlvàs), 3-15. 
Pečiulytė D., I. Nedveckytė, V. Dirginčiūtė-
Volodkienė, V. Būda, 2010. Pine defoliator 
Bupalus piniaria L. (Lepidoptera: Geometridae) 
and its entomopathogeneic fungi. Ekologija. 
Vol. 56. No. 1–2. P. 34–40.
IUCN, 2007. Banggai cardinalfish (Pterapogon 
kauderni), 2007 IUCN Red lish of threatened 
species. IUCN The word conservation union.
Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki, 2004. Fusarium 
66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
incarnatum isolated from black tiger shrimp 
Penaeus monodon Fabricius, with black gill 
disease cultured in Vietnam. Journal of Fish 
Diseases 27: 507-515.
Koch, R., 1876. Investigations into bacteria: V. The 
etiology of anthrax, based on the ontogenesis 
of Bacillus anthracis. Cohns Beitrage zur 
Biologie der Pflanzen (2): 277–310.
Vagelli, A., 2007. Synopsis of the biology và 
conservation status of the Banggai cardinalfish 
Pterapogon kauderni. Indonesian CITES 
Authorities, Jakarta.
Yanong, R. P. E., 2003. Fungal diseases of fish. Vet 
Clin Exot Anim. 6: 377–400. 
Wang, Y., Lu, L., Weng, S., Juang, J., Chan, S.-M., 
and He, J., 2007. Molecular epidemiology and 
phylogenetic analysis of a marine fish infectious 
spleen and kidney necrosis virus-like (ISKNV-
like) virus. Arch. Virol. 152, 763-773.
Weber, S., Waltzek, T., Young, D., Twitchell, E., 
Gates, A., Vagelli, A., Risatti, G., Hedrick, 
R., and Frasca, S., 2009. Systemic iridovirus 
infection in the Banggai cardinalfish (Pterapogon 
kauderni). J. Vet. Diag. Invest. 21, 306-320.
IDENTIFICATION OF FUNGI CAUSING INFECTION 
IN Pterapogon kauderni EGG DURING INCUBATION USING 
PCR AND SEM METHODS
Nguyen Thi Thuy Tien1, Vo Minh Son2 , Le Quynh Loan3, Nguyen Hoang Dung3, 
Hoang Quoc Khanh3, Ngo Duc Duy
3*
ABSTRACT
The goal of this study is to isolate and identify fungi strains from four specimen samples of 
Pterapogon kauderni eggs which were infected during incubation. The results were confirmed from 
the challenge test of fungi with eggs by technical SEM. Based on morphology, mycelium and spore 
characteristics, three filamentous fungi strains (M1, M1.1 and M4.1) were identified. The M1 strain 
belongs to Fusarium species, M1.1 strain belongs to Lecanicillium species and M4.1 strain belongs 
to Neurospora. The results of sequencing analysis of ITS (Internal Transcribed Spacer) gene 
region of M1, M1.1 and M4.1 strains and comparison with database on NCBI (National Center 
for Biotechnology Information ) showed that there was 100% similarity between M1 strain and 
Lecanicillium tenuipes, 100% similarity between M1.1 strain and Fusarium incarnatum and 99% 
similarity between M4.1 strain and Neurospora crassa. The results from the challenge of these three 
strains with Pterapogon kauderni eggs on technical SEM (Scanning Electron Microscope) pictures 
showed that only Neurospora crassa species can penetrate inside Pterapogon kauderni eggs during 
incubation. It can be concluded that Neurospora crassa species may cause infection and stop the 
hatching of Pterapogon kauderni eggs. 
Keywords: fish eggs, fungi, ITS gene, Pterapogon kauderni, SEM. 
Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Du
Ngày nhận bài: 02/11/2017
Ngày thông qua phản biện: 20/11/2017
Ngày duyệt đăng: 12/12/2017
1 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City
2 Research Institute for Aquaculture No.2
3 Insititute of Tropical Biology, Vietnam Academy Sciences and Technology
*Email: ngoduy007itb@gmail.com.