Tối ưu hóa điều kiện thủy phân thu nhận peptide có hoạt tính liên kết canxi từ phụ phẩm cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

rotein)X1 X2 X3
Nhiệt độ 
(oC)
Thời gian 
(phút)
Tỷ lệ enzyme 
(U/g)
1 -1 -1 -1 35 90 8 12,6785 13,4216
2 1 -1 -1 45 90 8 16,8606 16,1704
3 -1 1 -1 35 150 8 15,031 15,8060
4 1 1 -1 45 150 8 13,6914 14,7684
5 -1 -1 1 35 90 12 14,6351 14,3550
6 1 -1 1 45 90 12 17,4951 17,5737
7 -1 1 1 35 150 12 16,1207 17,2772
8 1 1 1 45 150 12 15,4506 16,7095
9 -1.682 0 0 31.59 120 10 13,4303 13,4420
10 1.682 0 0 48.41 120 10 15,9475 15,2764
11 0 -1.682 0 40 69.54 10 16,8147 15,4827
12 0 1.682 0 40 170.46 10 16,0886 16,7612
13 0 0 -1.682 40 120 6.63 16,1271 16,0313
14 0 0 1.682 40 120 13.36 18,9875 18,4488
15 0 0 0 40 120 10 18,1642 18,3379
16 0 0 0 40 120 10 18,1276 18,3379
17 0 0 0 40 120 10 17,9326 18,3379
18 0 0 0 40 120 10 19,4972 18,3379
19 0 0 0 40 120 10 17,9431 18,3379
20 0 0 0 40 120 10 19,1007 18,3379
115TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Từ kết quả thí nghiệm tối ưu hóa, giải bài 
toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu 
bằng phần mềm Modde 5.0, nhận được kết quả 
phương trình hồi quy của khả năng liên kết 
calcium theo các biến mã hóa như sau:
Y= 18,488 + 0,678X1 + 0,751X2 -1,131X1X2 
- 1,513X1
2 – 0,890X2
2 – 0,499X3
2
Kết quả phân tích ANOVA được trình bày 
trong Bảng 4.
Bảng 4. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của thí nghiệm tối ưu hóa
Hoạt tính liên kết 
calcium
DF SS MS F p SD
(variance)
Total 20 5521,21 276,061
Constant 1 5449,1 5449,1
Total Corrected 19 72,1167 3,79562 1,94823
Regression 9 66,9191 7,43545 14,3054 0 2,7268
Residual 10 5,19765 0,519765 0,720947
Lack of Fit 5 2,96805 0,59361 1,3312 0,381 0,770461
(Model Error)
Pure Error 5 2,2296 0,44592 0,667772
(Replicate Error)
N = 20 Q2 = 0,634 Cond. no. = 3,5909
DF = 10 R2 = 0,928 Y-miss = 0
R2 Adj. = 0,863 RSD = 0,7209
Trong đó R2: hệ số xác định; SS: tổng bình 
phương (sum of squares); DF: bậc tự do (degree 
of freedom); MS: trung bình bình phương 
(mean square); F: F-value. Giá trị F có độ tin 
cậy ở 95%. 
Dựa vào phân tich ANOVA ta thấy kết 
quả có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05) 
ở mức tin cậy là 95%. Hai giá trị Q2 và 
R2 cho biết mức độ tin cậy của mô hình 
thí nghiệm, R2 là độ biến thiên thực, còn 
Q2 là độ biến thiên ảo. Giá trị R2 = 0,928 
> 0,8; Q2 = 0,634 > 0,5 và |R2 –Q2| ∈ 
[0,2 -0,3] thỏa yêu cầu của quá trình tối ưu 
hóa cho thấy các giá trị hồi quy là có ý nghĩa 
và mô hình là đáng tin cậy (Eriksson et al., 
2000). Giá trị p của phân tích “lack of fit” là 
0,381 >0,05 cho thấy phương trình hồi quy 
tương ứng với thực nghiệm. Phương trình 
hồi quy được biểu diễn lên không gian ba 
chiều và bề mặt đáp ứng trong Hình 1.
116 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme đến hoạt tính liên kết canxi của 
peptide biểu diễn trong không gian ba chiều (trái) và hình chiếu bề mặt đáp ứng xuống 
mặt phẳng (phải).
IV. THẢO LUẬN
Theo nghiên cứu của Amiza et al. (2011) 
thì các thành phần protein, lipid và tro tương 
ứng là 25,02%, 68,21% và 7,08% ở phụ phẩm 
của silver catfish (Pangasius sp.). Như vậy có 
thể thấy phụ phẩm cá Tra có hàm lượng protein 
khá cao thích hợp để thu hồi peptide sinh học. 
Theo Muyonga et al. (2004), hàm lượng protein 
thô của nguyên liệu chính là hàm lượng thu hồi 
tối đa protein hydrolysate có thể đạt được.
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố 
nhiệt độ và thời gian trong quá trình thủy phân 
cho thấy hoạt tính liên kết calcium đạt cực đại 
khi tăng đồng thời nhiệt độ đến 40oC, thời gian 
đến 115 phút và sẽ giảm xuống khi tiếp tục 
117TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
tăng nhiệt độ và thời gian. Và điều này cũng 
xảy ra tương tự khi khảo sát sự ảnh hưởng của 
cặp yếu tố tỷ lệ enzyme với thời gian và cặp tỷ 
lệ enzyme với nhiệt độ. Điều này có thể được 
giải thích là khi mức độ thủy phân thấp các 
peptide có khả năng liên kết với calcium được 
giải phóng ra không đáng kể, theo thời gian khi 
mức độ thủy phân tăng dần hoặc ở các điều kiện 
nhiệt độ và tỷ lệ enzyme tối ưu, mức độ thủy 
phân tăng các peptide có hoạt tính này được giải 
phóng ra nhiều hơn dẫn đến hoạt tính liên kết 
canxi tăng dần và đạt cực đại. Tuy nhiên, khi 
protein bị thủy phân sâu sắc thì các peptide sẽ bị 
enzyme phân cắt nhỏ hơn làm thay đổi cấu trúc 
và thành phần acid amin, kết quả là làm cho khả 
năng liên kết với calcium giảm xuống (Jung et 
al., 2006b). 
Điều kiện tối ưu cho quá trình được xác 
định bằng phần mềm MODDE 5.0 cho thấy 
điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân là tại 
nồng độ E/S 11,8U/g, nhiệt độ là 41,8oC và thời 
gian là 108,26 phút thì hoạt tính liên kết calcium 
của peptide là 18,84 (mg/g protein). Để kiểm 
chứng tính chính xác của giá trị nhận được từ 
phương trình hồi quy, tiến hành 3 thí nghiệm lặp 
lại độc lập dựa trên giá trị thời gian, nhiệt độ, tỷ 
lệ enzyme tương tự thu được hoạt tính liên kết 
canxi là 18,69 ± 0,58 (mg/g). Kết quả này gần 
với kết quả dự đoán từ phương trình hồi quy 
nêu trên. So sánh với Huang và ctv., (2011a), tác 
giả đã tối ưu quá trình thu nhận peptide có hoạt 
tính liên kết calcium từ phụ phẩm của quá trình 
chế biến tôm bằng năm loại enzyme là alcalase, 
trypsin, pepsin, flavourzyme và protamex. Kết 
quả là peptide thu được từ quá trình thủy phân 
protein bằng trypsin có hoạt tính cao nhất trong 
năm enzyme và đạt 0,294 mmol Ca/g protein 
(hay 11,76 mg Ca/g protein).
Khả năng liên kết canxi của peptide 
phụ phẩm cá tra thủy phân bằng Trypsin là 
18,84mg/g protein cao hơn khi so với phụ 
phẩm tôm 11,76 mg/g protein (Huang G et al., 
2011a), thấp hơn khi so với protein thủy phân 
từ đậu nành 66,9mg/g proetin ( Bao XL et al., 
2007), protein dịch plasma huyết heo 50mg/g 
protein (Song K.B và Lee S.H, 2009), hoki 
frame 49mg/g protein (Jung W.K và Kim S.K, 
2007) và thấp hơn so với nghiên cứu của C. X. 
Thuy và ctv., (2014) khi thủy phân phụ phẩm 
cá Tra bằng Alcalase thu được peptide có hoạt 
tính 27,03mg/g. Tuy nhiên đây là hoạt tính của 
dịch peptide thô chưa qua tinh sạch. Hoạt tính 
này sẽ được tăng lên đáng kể trong các công 
đoạn tinh sạch sau này. Kết quả này bước đầu 
cho thấy phụ phẩm cá Tra là một nguồn hợp lí 
cho sản xuất peptide liên kết canxi.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu cho thấy phụ phẩm cá tra có 
thể sử dụng thành công để sản xuất bột peptide 
liên kết calcium. Điều kiện thủy phân như pH, 
thời gian, nhiệt độ, hàm lượng enzyme được tối 
ưu hóa thành công bằng RSM. Tại điều kiện tối 
ưu thời gian thủy phân là 108,26 phút nhiệt độ 
41,8oC, tỷ lệ E/S 11,8U/g, pH 8,0 mức độ liên 
kết canxi đạt cực đại là 18,69 (mg/g protein). 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Amiza, M.A., Ashikin, N., S., and Faazaz, A.L., 2011. 
Optimization of enzymatic protein hydrolysis from 
silver catfish (Pangasius sp.) frame, International 
Food Research Journal, Vol 18: p.751-757.
Bao, X.L., M.Song, J.Zhang, Y.Chen and S.T.Guo, 
2007. Calcium-binding ability of soy protein 
hydrolysates. Chin. Chem. Lett., 18: 1115-1118.
Bhaskar, N. and Mahendrakar, N.S., 2008. 
Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral 
waste proteins of Catla (Catla catla) for preparing 
protein hydrolysate using a commercial protease. 
Bioresource Technology 99(10): 4105-4111. 
C. X. Thuy, T. B. Lam, K. Mc. Commick, 2014. Optimizing 
of Nano-filtration to obtain fish protein isolate (FPI) 
from Pangasius hypophthalmus byproducts with 
calcium-binding bio-activity. Global Journal of 
118 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Agricultural Research. Vol.2, pp. 11-21.
Charoenphun, N., Cheirsilp, B., Sirinupong, N., 
Youravong, W., 2013. Calcium-binding peptides 
derives from tilapia (Oreochromis niloticus) protein 
hydrolysate. Eur Food Res Tech 266:57-63.
Choi, D.W., Lee, J.H., Chun, H.H., Song, K.B., 2012. 
Isolation of Calcium – binding Peptide from 
Bovine Serum Protein Hydrolysates. Food Sci. 
Biotechnol. 21 (6): 1663-1667.
Eriksson L., Johansson E., Kettaneh N., Wikstrom 
C., Wold S., (2000). Design of experiments- 
Principles and applications, Umetrics. 329p.
Gitelman. H.J.,1967. An Improved Automated 
Procedure for the Determination of Calcium in 
Biological Specimens. Analytical Biochemistry 
(18):521-531.
Huang. G.R., Ren L., Jiang J.X., 2011a. Purification of a 
histidine containing peptide with calcium binding 
activity from shrimp processing byproducts 
hydrolysate. Eur Food Res Tech 232:281-287.
Huang G, Ren Z, Jiang J, Chen W., 2011b. Preparation 
and Characteristic of Iron –Binding Peptides 
from Shrimp Processing Discards Hydrolysates. 
Advance Journal of Food Science and Technology 
3(5): 348-354.
Huang.G.R., Ren.Z.Y., Jiang J.X., 2014. Optimization 
of Hydrolysis conditions for Iron Binding peptides 
production from shrimp processing byproducts. 
American Journal of Food Technology 9(1): 49-55.
Jung, W.K., Karawita R., Heo, S.J., Lee, B.J., Kim, 
S.K., Jeon, Y.J., 2006a. Recovery of a novel Ca-
binding peptide from Alaska Pollack (Theregra 
chalcogramma) backbone by pepsinolytic 
hydrolysis. Process Biochem 41: 2097-2100.
Jung, W.K., Lee, B.J., Kim, S.K., 2006b. Fish-
bone peptide increase calcium solubility and 
bioavailability in ovariectomised rats. British 
Journal of Nutrition, 95: 124-128.
Jung, W.K., Kim, S.K., 2007. Calcium – binding 
peptide derived from pepsinolytic hydrolysates 
of hoki (Johnius belengerii) frame. Eur Food Res 
Tech 224:763-767.
Kristinsson, H. & Rasco, B. 2000. Biochemical and 
functional properties of Atlantic salmon (Salmo 
salar) muscle proteins hydrolyzed with various 
alkaline proteases. J. Agric. Food Chem. 48, 
657–666. 
Kristinsson, H. & Rasco, B. 2002. Fish Protein 
Hydrolysates and their potential use in the food 
industry.
Lim, J.W., Kim, S.B., 2004. Calcium-binding Peptides 
derived from Tryptic hydrolysates of Cheese 
whey protein. J. Korean.Soc.Appl.Biol.Chem.
Liu.F.R., Wang.L., Wang.R., Chen. Z.X., 2013. 
Calcium-Binding Capacity of Wheat Germ Protein 
Hydrolysate and Characterization of Peptide−
Calcium Complex. Journal of Agriculture and 
Food Chemistry (61): 7537-7544.
Madamba, P.S.,2002. The response surface 
methodology: An application to optimize 
operation of selected agriculture crops. LWT Food 
Science and Technology 35: 584-592.
Mahmoudreza, O., Majid, T., Ali, M., barbara,R., 
Abbas, E.M., 2009. Optimization of enzymatic 
hydrolysis of visceral waste proteins of beluga 
sturgeon Huso huso using Alcalase.
Motamedzadegan A., Davarniam B., Asadi G., 
Abedian A., Ovissipour M., 2010. Optimization of 
enzymatic hydrolysis of yellowfin tuna Thunnus 
albacares viscera using Neutrase. International 
Aquatic Research, Vol 2: p. 173-181.
Muyonga,J.H., Colec,C.G.B., Duodub,K.G., 2004. 
Extraction and physicochemical characterisation 
of Nile perch (Lates niloticus) skin and bone 
gelatine. Food Hydrocolloids8:581-592.
Nilsang, S., Lertsiri, S., Suphantharika, M. and 
Assavanig, A. 2005. Optimization of enzymatic 
hydrolysis of fish soluble concentrate by 
commercial protease. Journal of Food Engineering. 
70: 571-578.
Normah, I., Jamilah, B., Saari, N. and Che Man Yaakob, 
B. 2005. Optimization of hydrolysis conditions 
for the production of threadfin bream (Nemipterus 
japonicus) hydrolysate by Alcalase. Journal of 
Muscle Foods 16: 87–102
See S.F., Hoo L.L., Babji A.S., Optimization of 
enzymatic hydrolysis of Salmon (Salmo salar) 
skin by Alcalase, International Food Research 
Journal, Vol 18, 2011, p.1359-1365
Seung Hwan Lee and Kyung Bin Song, 2009. Isolation 
of a Calcium-binding Peptide from Enzymatic 
Hydrolysates of Porcine Blood Plasma Protein. J. 
Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 52(3), pp. 290-294.
Shahidi.F., Kamil.J.Y.A., 2001. Enzyme from fish and 
aquatic invertebrates and their application in the 
food technology. Trends Food Sci.Technol. 12, pp 
435-464 
Slizyte.R., Rustad.T., Storro.I., 2005. Enzymatic 
hydrolysis of cod (Gadus morhua) by-products: 
Optimization of yield and properties of lipid and 
protein fractions. Process Biochemistry 40, 3680-
3692. 
Song, K.B., Lee, S.H., 2009. Isolation of a Calcium-
binding Peptide from Enzymatic Hydrolysates 
of Porcine Blood Plasma Protein. J. Korean.Soc.
Appl.Biol.Chem, 52(3):290-294.
Won-Kyo Jung, Se-Kwon Kim, 2007. Calcium-binding 
peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of 
hoki (Johnius belengerii) frame. Eur Food Res 
Technol, pp. 763–767.
Wasswa, J., Tang, J. and Xiao, H.G. 2008. Optimization 
of the production of hydrolysates from Grass carp 
(Ctenopharyngodon idella) skin using Alcalase®. 
Journal of Food Biochemistry. 32: 460-473.
119TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
APPICATION OF RESPONSE SURFACE METHODOLOGY TO OPTIMIZE
 THE CALCIUM BINDING CAPACITY OF PROTEIN HYDROLYSATE FROM
 TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) BY-PRODUCTS
Nguyen Thi Huong Thao1*, Dinh Thi Men1, Tran Duc Vinh2, Vo Dinh Le Tam2
ABSTRACT
Calcium is an essential mineral nutrient required for biological functions in the body such as 
nerve conduction, muscle contraction, blood coagulation and structural support of the skeleton. In 
some case, the body is unable to absorb calcium from dietary food because of the precipitation of 
insoluble calcium salts in the intestinal lumen. Therefore, the development of methods to enhance 
the solubility of calcium can promote calcium absorption and improve its bioavailability. Organic 
calcium has been proposed as superior alternative to inorganic calcium. The aim of this study was 
optimize the enzymatic hydrolysis conditions for producing peptide with high calcium binding 
capacity from tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus) by-products. Hydrolysis conditions 
were optimized by using a response surface methodology (RSM) with calcium-binding capacity 
as response. An enzyme to substrate level of 11.8U/g, temperature of 41.8oC, the time of 108.26 
minutes and pH of 8.0 were found to be the optimum conditions to obtain the highest calcium 
binding capacity 18.69 mg/g protein using trypsin. The generated model showed a quadratic fit with 
experimental data and RSM was also proven a great optimizing tool. The results suggested that tra 
catfish by-products are a good source for producing calcium-binding peptides. 
Keywords: calcium-binding peptide, enzymatic hydrolysis, fish protein hydrolysate, response 
surface methodology, Tra catfish by-products.
Người phản biện: ThS. Lê Vịnh
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015
1. Research Center for Aquafeed nutrition and Fishery post-harvest Technology, Research Institute for Aquaculture No2. 
* Email: nthuongthao@yahoo.com 
2. HCMC University of Technology