Study of transmission of infectiou hyperdermal and hematopietic necrosis virus (IHHNV) in black tiger shrimp (Peneus monodon)

NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
 3.5. Ảnh hưởng của lượng khí thổi vào 
lên sự phát triển của E. ictaluri
Thí nghiệm 7: Kết quả khảo sát tốc độ 
khuấy 200 vòng/phút với các lượng khí thổi vào 
lần lượt là 2, 4, 6 và 8 lít/phút ở nồi lên men cho 
thấy ở nghiệm thức với lượng khí thổi vào là 
6 lít/phút vi khuẩn phát triển đến mức cực đại 
sau 36h nuôi cấy trong nồi lên men (đồ thị 9). 
Tuy nhiên, sau đó mật độ vi khuẩn giảm dần. 
So với các nghiệm thức khác thì ở nghiệm thức 
với lượng khí thổi vào là 8 lít/phút cho thấy vi 
khuẩn tăng nhanh mật độ sau 30h nuôi cấy, sau 
đó có sự biến động tăng giảm nhưng vẫn duy trì 
ở mức mật độ cao cho đến 48h nuôi cấy trong 
nồi lên men. Nghiệm thức có lượng khí thổi vào 
2 lít/phút cho thấy có giá trị OD thấp nhất so 
với các nghiệm thực khác ở hầu hết các điểm 
thu mẫu.
Kết quả thu mẫu cấy trải đĩa trên môi 
trường BHIA cho thấy mật độ vi khuẩn cao 
nhất ở nghiệm thức có tốc độ khuấy là 200 
vòng/phút và lượng khí thổi vào là 6 lít/phút 
(đồ thị 10). Tiếp theo đó là 200 vòng/phút và 
lượng khí thổi vào là 8 lít/phút. Cũng giống 
như kết quả đo OD, mật độ vi khuẩn ở lượng 
khí thổi vào 2 lít/phút là thấp nhất. Điều này 
cho thấy đối với vi khuẩn hiếu khí thì oxy rất 
cần thiết cho sự phát triển.
3.6. Sản xuất vaccine bất hoạt thông qua 
sốc nhiệt protein trong vaccine
Thí nghiệm này được thử nghiệm 2 tốc độ 
khuấy (150 và 200 vòng/phút) và 2 lượng khí 
thổi vào (6 và 8 lít/phút) và tiến hành thu vi 
khuẩn tại các thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ 
sau đó tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn ở nhiệt độ 
410C trong 30 phút (điều kiện tối ưu sốc nhiệt 
như đã trình bày ở phần trên) sau đó bất hoạt vi 
khuẩn bằng formalin 0,4% trước khi thử nghiệm 
vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản 
xuất vaccine tốt nhất thông qua tỷ lệ bảo hộ của 
các nghiệm thức này. Trong quá trình thực hiện 
thí nghiệm này chúng tôi cũng thu mẫu kiểm tra 
OD và mật độ vi khuẩn cho từng nghiệm thức. 
Kết quả giá trị OD và số lượng tế bào/ml ở các 
nghiệm thức (đồ thị 11 và 12) cho thấy ở tốc 
độ khuấy 200 vòng/phút và 150 vòng/phút với 
lượng khí thổi vào 8 lít/phút vi khuẩn phát triển 
tốt hơn so với nghiệm thức có tốc độ khuấy như 
trên nhưng lượng khí thổi vào 6 lít/phút. Bên 
cạnh đó, số lượng tế bào bắt đầu phát triển mạnh 
trong thời gian 33-36 giờ và bắt đầu giảm dần 
đến thời điểm 39 giờ. Trong khoảng thời gian 
33-39 giờ thu sinh khối vi khuẩn và sốc nhiệt 
kiểm tra khả năng bảo hộ của vaccine ở 3 thời 
điểm 33, 36, 39 giờ với điều kiện trục khuấy 
150, 200 vòng/phút và lượng khí thổi vào 6 và 8 
lít/phút. Ở phần sản xuất vaccine cho thí nghiệm 
này vi khuẩn được sốc nhiệt ở 41oC trong thời 
gian 30 (dựa trên kết quả các nội dung khác 
thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài này)
Đồ thị 11. Giá trị OD của E. ictaluri khi nuôi cấy 
trong nồi lên men với tốc độ khuấy 150 và 200 vòng/
phút ở các mức lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút
Đồ thị 12. Mật độ E. ictaluri khi nuôi cấy trong nồi 
lên men với tốc độ khuấy 150 và 200 vòng/phút ở 
lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút
118 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Kết quả tỷ lệ chết được trình bày ở đồ thị 
13 cho thấy tỷ lệ chết các nghiệm thức với trục 
khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/
phút tại thời điểm thu mẫu 36, 39 giờ và trục 
khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 8 tại 
thời điểm thu mẫu 39 giờ có tỷ lệ chết dưới 50% 
và khác biệt đáng kể với các nghiệm thức còn 
lại (p<0,05). Ngoài ra, tỷ lệ RPS (%) cho thấy tỷ 
lệ bảo hộ của vaccine ở nghiệm thức 200-6-36H 
(200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/phút, 
thu mẫu ở thời gian 36 giờ) là 53%, trong khi 
đó các nghiệm thức 200-6-39H, 200-8-39H lần 
lượt là 49,4% và 48,2%. Các nghiệm thức còn 
lại dao động 23%-33%. Điều này có thể khẳng 
định pH môi trường cho quá trình lên men, tốc 
độ khuấy, lượng khí thổi vào và thời gian thu 
hoạch vi khuẩn có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả 
của vacvine.
Đồ thị 13. Tỷ lệ chết cộng dồn cá thí nghiệm 
sau khi được tiêm các nghiệm thức vaccine 
khác nhau và gây nhiễm với E. ictaluri
IV. THẢO LUẬN
Sự khác biệt về tốc độ phát triển của vi 
khuẩn trên các loại môi trường khác nhau. 
Điều này cũng được ghi nhận ở các nghiên 
cứu khác khi sử dụng các loại môi trường khác 
nhau. Khi cấy Escherichia coli O157:H7 và 
Staphylococcus aureus trong môi trường Brain 
Heart Infusion (BHI) với nhiều nồng độ muối 
khác nhau Hajmeer và ctv (2006) tìm thấy nhiều 
tế bào bị tổn thương ở nồng độ muối 5-10%.
Theo Jiang và Chai (1996), sự khác biệt 
về tổng số vi khuẩn đếm được trên môi trường 
chọn lọc và không chọn lọc phản ánh số lượng 
tế bào bị tổn thương do yếu tố vật lý hoặc hóa 
học. Lee và ctv (2006) mô tả ảnh hưởng của độ 
mặn và pH lên khả năng mọc của V. parahaemo-
lyticus trên môi trường TCBS. Nhóm tác giả 
này đi đến kết luận rằng PBS-3% NaCl (pH 6.6) 
thích hợp nhất cho V. parahaemolyticus phát 
triển. Sự khác biệt về môi trường có thể dẫn 
đến vận tốc phát triển khác nhau. So sánh 4 loại 
môi trường nuôi cấy V. vulnificus (1) cellobiose-
colistin (CC) agar, (2) Vibrio vulnificus medium 
(VVM), (3) a modification of VVM agar (VVMc 
agar), và môi trường TCBS, Cerdà-Cuéllar và 
ctv (2001) tìm thấy VVMc 
agar là môi trường tốt nhất 
cho V. vulnificus. Kết quả 
ở đồ thị 4.3 cho thấy ở môi 
trường BHIB E. ictaluri 
phát triển mạnh hơn so với 
các môi trường còn lại. Đặc 
biệt đối với môi trường 
Hottinger giá trị OD ở các 
thời điểm thu mẫu rất thấp 
và hầu như vi khuẩn không 
phát triển trong suốt thời 
gian thí nghiệm. Có thể là 
đối với môi trường này và 
với lượng vi khuẩn cấy vào ban đầu ít làm ảnh 
hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của khẩu phần dinh 
dưỡng đến tăng trưởng, thành phần các chất 
trong cơ thể, các chỉ tiêu huyết học và đặc biệt 
là khả năng đề kháng với Edwardsiella ictaluri 
của cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus, Lim và ctv 
(2009) cũng đã dùng môi trường BHIB để tăng 
sinh vi khuẩn cho thí nghiệm gây cảm nhiễm. 
TSB được nhóm tác giả Crumlish và ctv (2002) 
sử dụng làm môi trường tăng sinh E. ictaluri 
119TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
trong nghiên cứu phân lập định danh tác nhân 
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra thu tại ĐBSCL.
Các nghiên cứu trong nước cho thấy BHIB đã 
được một số tác giả dùng để tăng sinh E. ictaluri 
như Phạm Công Thành (2010), Nguyễn Quốc 
Bình và ctv (2010), Nguyễn Hữu Thịnh và ctv 
(2009). Tuy nhiên các tác giả này không có 
nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của E. 
ictaluri trên các loại môi trường mà chúng tôi sử 
dụng trong thí nghiệm này.
Theo Natha và ctv (2009) khi nghiên cứu 
sự phát triển của E. ictaluri cho thấy loài vi 
khuẩn này không có khả năng phát triển trên 
môi trường BHIB ở pH thấp. Tuy nhiên, khi có 
bổ sung thêm nguồn urea thì vi khuẩn này có 
khả năng phát triển ở pH = 5. Shotts và Waltman 
(1990) khi nghiên cứu phát triển của E. ictaluri 
trên môi trường Edwardsiella ictaluri agar cũng 
chọn pH = 7-7,2. Các dẫn liệu này cho thấy kết 
quả của thí nghiệm này khá tương thích với các 
kết quả trước đây nghiên cứu pH lên sự phát 
triển của E. ictaluri. Theo Collins và Thune 
(1996) khi khảo sát sự phát triển của E. ictaluri 
trên môi trường pha chế có bổ sung nhiều thành 
phần bao gồm khoáng, vitamine, acid amine,... 
với các giá trị pH khác nhau cho thấy mật độ vi 
khuẩn cao nhất ở pH = 7-7,5. Ở các giá trị pH 
khác quan sát có sự giảm về mật độ vi khuẩn từ 
23-61%. Đặc biệt không thấy sự phát triển của 
vi khuẩn ở pH = 4 và 9. Điều này cũng phù hợp 
với nghiên cứu của Plumb và Vinitnantharat cho 
thấy khoảng pH thích hợp cho E. ictaluri phát 
triển trên môi trường BHI là 7-7,5. 
Tất cả các loài vi khuẩn đều có thời gian 
thích nghi với môi trường trước khi trãi qua pha 
phát triển theo cấp số nhân, khoảng thời gian 
này dài hay ngắn tùy thuộc vào loài vi khuẩn. 
Nghiên cứu trên E. ictaluri cho thấy loài vi khuẩn 
này phát triển chậm hơn so với các loài vi khuẩn 
khác. Vì vậy phase lag thường kéo dài hơn 10h. 
Israil và ctv (2009) theo dõi đường cong sinh 
trưởng của Vibrio ghi nhận pha lag mất khoảng 
6-8h. Nhóm tác giả này cũng ghi nhận điễn biến 
đường cong sinh trưởng khác nhau tùy theo loại 
môi trường sử dụng và có bổ sung hay không bổ 
sung các chất ức chế. Việc nghiên cứu đường 
môi trường nuôi cấy thích hợp và đường cong 
sinh trưởng trong đề tài này giúp cho việc quyết 
định thời gian thu hoạch vi khuẩn chuẩn bị cho 
phản ứng gây bệnh thực nghiệm, các phản ứng 
gây sốc hoặc thu vi khuẩn để sản xuất vaccine.
Qua khảo sát cho thấy ở tốc độ 250 vòng/
phút mặc dù OD có giá trị cao nhất nhưng số 
khuẩn lạc trên đĩa thạch không khác biệt lớn 
so với tốc độ khuấy 200 vòng/phút. Sự khác 
biệt này có thể là do khi đo mật độ OD có cả vi 
khuẩn chết trong canh khuẩn. Hơn nữa, với tốc 
độ khuấy mạnh trong nồi lên men sẽ làm lượng 
bọt nhiều và việc điều chỉnh lượng khí trong nồi 
lên men trở nên khó khăn hơn.
V. KẾT LUẬN
E. ictaluri có thể phát triển trên các môi 
trường Nutrient Broth (NB), Brain Heart 
Infusion Broth (BHIB), Tryptic Soy Broth 
(TSB) nhưng phát triển tốt nhất trên BHIB. 
E. ictaluri phát triển tốt ở pH = 6. Tuy 
nhiên, pH vừa thích hợp cho sự phát triển và 
duy trì độc lực của của E. ictaluri là 7,0.
Liều vaccine 3 x 109 có khả năng kích 
thích sinh miễn dịch và bảo hộ cho cá với tỷ lệ 
chết khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm 
đối chứng.
Tốc độ khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi 
vào 6 phút/lít cho sự phát triển và kích thích sinh 
miễn dịch tốt của E. ictaluri với RPS = 53%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Thị 
Thanh Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, 
Trần Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ 
Hy Lan Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh 
Thanh, 2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine 
phòng bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được 
triển khai tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học 
Thành phố Hồ Chí Minh. Hội nghị Công Nghệ 
Sinh Học toàn quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.
120 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Phạm Công Thành, 2010. Khảo sát đáp ứng miễn 
dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 
nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Luận văn 
Cao học trường Đại Học Nông Nông Tp.HCM.
Tài liệu tiếng Anh
Cerdà-Cuéllar, M., Permin, L., Larsen, J.L. and 
Blanch, A.R., 2001. Comparison of selective 
media for the detection of Vibrio vulnificus 
in environmental samples. Journal Appllied 
Microbiology 91, 322-327.
Collines, L.A. and Thune, R.L., 1996. Development 
of a Defined Minimal Medium for the Growth of 
Edwardsiella ictaluri. Applied and Environemntal 
Microbiology 62(3), 848-852.
Crumlish, M., Dung, T., Turnbull, J., Ngoc, N. and 
Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli 
from the diseased freshwater catfish Pangasius 
hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong 
Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25, 
733-736.
Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J.L. and Fung, 
D.Y.C., 2006. Impact of sodium chloride on 
Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus 
aureus analysed using transmission electron 
microscopy. Food Microbiology 23, 446-452.
Jiang, X., and Chai, T. J., 1996. Survival of Vibrio 
parahaemolyticus at low temperatures under 
starvation conditions and subsequent resuscitation 
of viable, nonculturable cells. Applied 
Environmental Microbiology 62, 1300-1305.
Lim, C., Yildirim-Aksoy, M. and Klesius, P.H., 2009. 
Growth Response and Resistance to Edwardsiella 
ictaluri of Channel Catfish, Ictalurus punctatus, 
Fed Diets Containing Distiller’s Dried Grains 
with Solubles. Journal of the World Aquaculture 
Society 40 (2), 182-193.
Natha, J. B., Judith, B. B., and Ronald, L.T., 
2009. Edwardsiella ictaluri Encodes an 
Acid-Activated Urease That Is Required for 
Intracellular Replication in Channel Catfish 
(Ictalurus punctatus) Macrophages. Applied and 
Environmental Microbiology 75 (21), 6712-6720.
Plant, J., 2009. A mutation in Thermosensitive Male 
Sterile 1, encoding a heat shock protein with 
DnaJ and PDI domains, leads to thermosensitive 
gametophytic male sterility in Arabidopsis. Mar 
57(5), 870-82.
Shotts, E. B., and Waltman, W. D., 1990. “A Medium for 
The Selective Isolation of Edwarsiella ictaluri”. 
Journal of Wildlife Diseases 26 (2), 214-218. 
Yeong, Y. S., Van Damme, E. J. M., Sorgeloos, P., and 
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect 
gnotobiotic Artemia franciscana larvae against 
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology 
22, 318-326.
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos, 
P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic 
Artemia franciscana larvae to abiotic stress 
promotes heat shock protein 70 synthesis and 
entăngces resistance to pathogenic Vibrio 
campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1), 59-66.
121TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
STANDARDIZATION OF CONDITIONS FOR PRODUCING INACTIVAED 
VACCINE IN PREVENTING OF BACILLARY NECROSIS OF PANGASIUS
Le Hong Phuoc1, Vo Hong Phuong1, Nguyen Thi Hien1, Ngo Thi Bich Phuong1, 
Nguyen Pham Hoang Huy1, Chung Minh Loi1
ABSTRACT
This study was conducted to standardize the conditions for producing inactivated vaccine in preventing of 
Bacillary Necrosis of Pagasius (BNP). The bacterial strain, Edwardsiella ictaluri, was isolated from diseased 
fish collected from Mekong Delta with the typical signs of BNP. Edwardsiella ictaluri was cultured in four 
different broth medium e.g. Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth 
(TSB) và Hottinger. It was found that E. ictaluri grew best in BHIB. The optimal pH for developing and 
mentaining the virulence of this bacterial strain is 7.0. Different conditions in the fermentor were also tested. 
It was verified that stiring at 200 rpm, oxygen supplied 6 l/min and harvesting of bacteria at 36h resulted in a 
good effectiveness in stimulating immune response of striped catfish to Edwardsiella ictaluri. Inactivaed vac-
cine showed no toxic to the stripe catfish. Vaccinated dose of 3 x 109 CFU/fish can stimimlated the immune 
reponse of fish as the result of getting RPS = 53%. There was a significant different in mortality between the 
control and vaccinated groups (p < 0.05).
Keywords: striped catfish, vaccine, Edwarsiella ictaluri
Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Hảo
Ngày nhận bài: 10/06/2014
Ngày thông qua phản biện: 16/06/2014
Ngày duyệt đăng: 20/6/2014
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2 
 Email: lehongphuoc@yahoo.com