Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

i khuẩn lactic còn sinh H2O2 có khả 
năng diệt khuẩn Gram âm và cả Gram dương 
với cơ chế sinh ra supeoxide (O2-) và các gốc 
hydroxyl (OH-) tự do phá hủy DNA tạo hiệu 
quả diệt khuẩn (Dilek, 2014). Bên cạnh đó, A. 
hydrophila và E. ictaluri đều là vi khuẩn Gram 
âm cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được 
có nhiều khả năng đối kháng được với hai chủng 
vi khuẩn gây bệnh trên. Thực tế từ nghiên cứu 
này đã cho thấy, trong 96 chủng vi khuẩn lactic 
chọn lọc được, có 46 chủng thể hiện tính đối 
kháng và 3 chủng có khả năng sinh bacteriocin. 
Trong đó, các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 
cá tra chiếm số lượng nhiều nhất với 22 chủng, 
15 chủng phân lập từ cá lăng. Vi khuẩn lactic 
phân lập từ cá vồ đém có 7 chủng, từ cá trê chỉ 
có 2 chủng thể hiện tính đối kháng và vi khuẩn 
phân lập từ cá hú không thể hiện tính đối kháng 
với A. hydrophila. Hầu hết các chủng vi khuẩn 
lactic đều thể hiện tính kháng trung bình (với 
đường kính vùng vô trùng trung bình (d) từ 
4,5mm đến 9,5mm) và yếu (d= 2mm ÷ 4mm) 
(Aslim và ctv., 2005) (Hình 2). 
Hình 2: Đường tròn vô trùng tạo ra bởi vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin đối với vi khuẩn 
Aeromonas hydrophila. (+): đối chứng dương (kháng sinh Doxycycline 100ppm); (-): đối chứng âm 
(môi trường MRS lỏng); 1.1, 2.1: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý; 1.2, 2.2: dung dịch 
ly tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6,5-7) bằng dung dịch NaOH 1M. 
Ngoài acid hữu cơ và H2O2, vi khuẩn lactic 
còn có khả năng sinh bacteriocin, bacteriocin là 
những chuỗi peptide hay protein được sinh ra 
bởi một vài chủng vi khuẩn, hầu hết bacteriocin 
diệt những tế bào đích bằng tính thấm của màng 
tế bào và hoạt động đặc hiệu vì chúng yêu cầu 
những chất thụ cảm đặc hiệu trên bề mặt tế 
bào đích. Bacteriocin được phân loại theo đặc 
điểm sinh hóa và đặc điểm di truyền, trong 
đó Nisin (L. lactis) và Pediocin (Pediococcus 
acidilactici) là những bacteriocins phổ biến và 
được sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm 
lên men (Dilek, 2014). Nhiều báo cáo đã chứng 
minh dòng Lactobacillus có khả năng sinh 
bacteriocins “lactocidin”. Thực tế, nghiên cứu 
đã tìm ra được 3 chủng CL2, CL10.20 (phân 
lập từ cá lăng) và CT3.7 (phân lập từ cá tra) 
có khả năng sinh bacteriocin trung bình và yếu 
với đường kính vòng vô trùng lần lượt là 9mm, 
4mm và 2mm (Bảng 2). 
61TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bảng 2: Bảng đường kính vòng vô trùng gây ra bởi hoạt động kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 
chỉ kháng với Aeromonas hydrophila
A.hydrophila
Nguồn 
phân lập
Tên chủng
Khả năng đối kháng Khả năng sinh bacteriocin
Đường kính vòng 
vô trùng (mm)
Độ nhạy(*)
Đường kính vòng 
vô trùng (mm)
Độ nhạy(*)
Cá tra CT8.3 8 (++) 0 (-)
CT7.3 7 (++) 0 (-)
CT8.7 7 (++) 0 (-)
CT8.15 7 (++) 0 (-)
CT3.6 6 (++) 0 (-)
3. CT3.7 4. 6 5. (++) 6. 2 7. (+)
CT4.4 6 (++) 0 (-)
CT8.11 6 (++) 0 (-)
CT8.16 6 (++) 0 (-)
CT10.8 6 (++) 0 (-)
CT7.1 5 (++) 0 (-)
CT8.6 5 (++) 0 (-)
CT10.2 5 (++) 0 (-)
CT3.8 4 (+) 0 (-)
CT4.9 4 (+) 0 (-)
CT4.10 4 (+) 0 (-)
CT2.8 3 (+) 0 (-)
CT2.1 2 (+) 0 (-)
CT2.9 2 (+) 0 (-)
CT3.3 2 (+) 0 (-)
CT3.4 2 (+) 0 (-)
CT7.2 2 (+) 0 (-)
62 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cá lăng CL2 13 (++) 9 (++)
CL10.20 6 (++) 4 (+)
CL8.20 3 (+) 0 (-)
CL8.21 3 (+) 0 (-)
CL9.3 3 (+) 0 (-)
CL9.6 3 (+) 0 (-)
CL10.14 3 (+) 0 (-)
CL10.22 3 (+) 0 (-)
CL10.29 3 (+) 0 (-)
CL3 2 (+) 0 (-)
CL8.26 2 (+) 0 (-)
CL10.7 2 (+) 0 (-)
CL10.10 2 (+) 0 (-)
CL10.23 2 (+) 0 (-)
CL10.37 2 (+) 0 (-)
Cá trê TV3 4 (+) 0 (-)
TV4 4 (+) 0 (-)
Cá vồ 
đém
VD4.8 10 (++) 0 (-)
VD4.11 9 (++) 0 (-)
VD5.3 9 (++) 0 (-)
VD1.5 5 (++) 0 (-)
VD4.6 5 (++) 0 (-)
VD4.7 5 (++) 0 (-)
VD1.6 2 (+) 0 (-)
Đối 
chứng
DC(+) 14 (++)
DC(-) 0 (-)
(*) (+): khả năng kháng khuẩn yếu (d=2÷4mm), (++) khả năng kháng khuẩn trung bình (d=4÷14mm), (+++) khả 
năng kháng khuẩn mạnh (d=14÷24mm), (-) Không nhạy (d=0)
3.4. Định danh các chủng vi khuẩn lactic 
có khả năng sinh bacteriocin thô
Sau khi đã tìm được 3 chủng vi khuẩn 
lactic (CL2, CL20 và CL3.7) có khả năng sinh 
bacteriocin thô, các chủng này được phục hồi và 
tách ròng trên đĩa thạch MRS. Sau đó gửi mẫu 
đến Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam 
Khoa, thực hiện định danh, giải trình tự gen 16S 
rRNA và được tra cứu trên BLAST SEARCH 
Kết quả, 2 chủng CL2 và CL10.20 phân lập từ 
cá lăng xác định là chủng Lactobacillus reuteri 
HFI-LD5 có độ tương đồng theo thứ tự 100% 
(548/548bp) và 99% (551/552bp), chủng CT3.7 
phân lập từ cá tra xác định là chủng Lactobacillus 
fermentum JCM- 1173 với độ tương đồng 100% 
(539/539bp). Trình tự gen của các chủng vi 
khuẩn này được trình bày ở Bảng 4.
63TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bảng 4: Trình tự gen của Lactobacillus fermentum JCM- 1173 và Lactobacillus reuteri HFI-
LD5
Chủng Trình tự gen
Lactobacillus fer-
mentum JCM- 1173
AT C C T G G C T C A G G AT G A A C G C C G G C G G T-
GTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTG -
GCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT-
GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT-
G A G TA A C A C G TA G G TA A C C T G C C C A G A A G -
CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATAC-
CGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCT-
TAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATG-
GACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAAC-
GGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTT-
GAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGA-
CACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAG -
TAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATG-
GAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCG-
GCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACG-
TATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTA-
ACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAG
Lactobacillus reuteri 
HFI-LD5
GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGC-
CGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACG-
CACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCT-
GATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGAC-
GGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGC-
GGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCG-
CATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAA-
GATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCT-
GCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCT-
TACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGA-
CTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTC-
CATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC-
CACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGC-
GTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCT-
GTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACT-
GTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGT-
CACGGCTAACTACGTGCCAG
Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram 
dương, thuộc loài Lactobacillus, được tìm thấy 
trong quá trình lên men nguyên liệu động vật 
và thực vật. L. fermentum được xác định như 
64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
probiotic tiềm năng với khả năng làm giảm 
cholesterol tốt hơn hẳn các loài Lactobacillus 
khác bằng việc hấp thụ cholesterol, thúc đẩy 
quá trình chuyển hóa cholesterol. Một nghiên 
cứu khác của Allameh và ctv., 2013, đã xác định 
L. fermentum HM579790, được phân lập từ dạ 
dày cá lóc (Channa striatus) sống tự nhiên, có 
tiềm năng làm probiotic trong nuôi cá lóc khi 
cho thấy khả năng ức chế A. hydrophila cao 
nhất trong 13 chủng vi khuẩn phân lập được 
trong điều kiện in vitro với đường kính vùng vô 
trùng 8mm và khả năng cải thiện tỉ lệ sống của 
cá lóc (Channa striatus) có ý nghĩa thống kê 
khi bổ sung 2x106CFU/g vi khuẩn L. fermentum 
vào khẩu phần. Trong nghiên cứu này, chủng 
L. fermentum JCM-1173 được sàng lọc từ 
đường ruột cá tra, tuy khả năng đối kháng (sử 
dụng dịch huyền phù được lọc vô trùng) của 
L. fermentum JCM-1173 (6mm) nhỏ hơn L. 
fermentum HM-579790 (8mm) nhưng nghiên 
cứu đã xác định được khả năng sinh bacteriocin 
đối với A.hydrophila. 
Lactobacillus reuteri được ghi nhận vào 
phân loại khoa học của vi khuẩn lactic vào đầu 
thế kỉ 20, mặc dù vào thời điểm này, loài này 
bị nhầm lẫn với nhóm vi khuẩn Lactobacillus 
fermentum. Đến những năm 60 của thế kỉ 20, 
nhà vi sinh học người Đức Gerhard Reuter đã 
phân biệt L. reuteri và L. fermentum và phân 
loại vào loài L. fermentum dạng sinh học II. 
Đến năm 1980, Kandler và cộng sự đã xác định 
sự khác biệt rõ giữa L. reuteri và những dạng 
sinh học khác của L. fermentum, từ đó tên khoa 
học “reuteri” đã được chọn theo tên của nhà 
khoa học Gerhard Reuter để phân biệt với L. 
fermentum. L. reuteri được phân lập từ nhiều 
nguồn thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm từ 
thịt và sữa. L. reuteri là vi khuẩn lên men dị 
hình, Gram dương, hình que cong với đầu tròn 
đơn, theo cặp hoặc những cụm nhỏ, hoạt động 
probiotic của loài này được thể hiện qua khả 
năng ức chế hoạt động của tác nhân gây bệnh, 
kết hợp nhiều cơ chế bao gồm sản sinh acid 
lactic, H2O2 và bacteriocin. Bacteriocin sinh ra 
bởi loài này là reuterin. Reuterin là hợp chất 
trung tính của các phân tử nhẹ, tan trong nước, 
hoạt động trong khoảng pH rộng và kháng với 
enzyme phân giải protein và lipid, có khả năng 
ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây hại 
gram dương và Gram âm, các loài thuộc nấm 
và động vật nguyên sinh. Đã có những nghiên 
cứu tìm thấy L. reuteri có thể sinh đủ lượng 
reuterin để gây ra những hiệu quả diệt khuẩn 
đáng mong đợi (Lei et al., 2011). Nghiên cứu 
này được xem như nghiên cứu khởi phát cho 
việc phát hiện L. reuteri tồn tại trong ruột động 
vật thủy sản, cụ thể là cá lăng sống tự nhiên với 
khả năng đối kháng và sinh bacteriocin đối với 
A. hydrophila. 
Kết quả này có ý nghĩa rất lớn cho những 
nghiên cứu về vi khuẩn có tiềm năng làm 
probiotic trong phòng bệnh gan thận mủ và 
bệnh xuất huyết trên cá tra khi mà việc sử dụng 
sinh vật đối kháng và bacteriocin để ức chế lại 
A.hydrophila là vấn đề tương đối mới vì hiện 
nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào được thực 
hiện trong và ngoài nước sử dụng Lactobacillus 
spp. hay bacteriocin do vi khuẩn sinh ra để ức 
chế lại.
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận: Trong nghiên cứu này đã thực 
hiện phân lập được 96 chủng vi khuẩn lactic 
từ ruột cá da trơn tự nhiên, trong đó có 46 
chủng thể hiện tính đối kháng vi khuẩn gây 
bệnh A.hydrophila. Từ nghiên cứu, đã tìm 
được 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh 
bacteriocin thô, có tiềm năng sử dụng làm 
probiotic. Kết quả định danh đã xác định 2 
chủng sinh bacteriocin phân lập từ cá lăng là 
Lactobacillus reuteri, chủng phân lập từ cá tra 
là Lactobacillus fermentum.
Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu về tối ưu hóa 
điều kiện môi trường nuôi đối với khả năng 
đối kháng và sinh bacteriocin của L. reuteri 
và L. fermentum, tiếp tục nghiên cứu hợp chất 
bacteriocin sinh ra bởi L. fermentum, thực 
hiện nghiên cứu khả năng đối kháng và sinh 
bacteriocin của hai chủng vi khuẩn này đối với 
các chủng vi khuẩn gây bệnh khác trên động vật 
thủy sản, thực hiện thí nghiệm trong điều kiện 
in vivo,
65TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Dương Thị Kim Loan, 2013. Phân lập và đánh giá 
khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đối 
với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan 
thận mủ trên cá tra (Pangasius hypothalamus). 
Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản, 
2013, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012. 
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus 
sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan 
thận mủ và đốm đỏ trên cá tra. Tạp chí Khoa 
học Đại học Cần Thơ, 2012:23a 224-234.
Quách Văn Cao Thi, Từ Thanh Dung và Đặng Phạm 
Hòa Hiệp, 2014. Hiện trạng kháng thuốc kháng 
sinh trên hai loài vi khuẩn Edwardsiellaictaluri 
và Aeromonashydrophila gây bệnh trên cá tra 
(Pangasianodonhypophthamus) ở Đồng bằng 
sông Cửa Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại 
học Cần Thơ, Số chuyên đề: Thủy Sản (2014) 
(2): 7-14. 
Tài liệu tiếng Anh
Allameh, S.K., F.M. Yusoff, H.M. Daud, E. Ringø, 
A.Ideris and C. R.Saad, 2013. Characterization 
of probiotic Lactobacillus fermentum isolated 
from snakehead, Channa striatus, stomach. 
Journal of the World Aquaculture Society. 
Volume 44, Issue 6, pages 835–844, December 
2013.
Aslim, B., Z. N. Yuksekdag, E. Sarikaya and 
Y. Beyatli, 2005. Determination of the 
bacteriocin-like substances produced by some 
lactic acid bacteria isolated from Turkish dairy 
products. LWT. 38: 691-694.
Barrow, G.I. and Feltham, R.K.A. (1993). Cowan 
and steel’s manual for the identification of 
medical bacteria. 3rd Edition, Cambridge 
University Press, Cambridge, 331.
Chen, H. and Hoover, D., 2003. Bacteriocins and 
their Food Applications. Compr. Rev. Food 
Science. Food Safety, 2: 82-89.
Dilek Heperkan, 2014. Antimicrobial activity 
of lactic acid bacteria on pathogens in foods 
– Why successful? How successful?. Food 
Technology 2014, 21-23 July, Las Vegas.
Lei, B., A. L. Molan, L. S. Maddox, Q. Shu, 
2011. Antimicrobial activity of Lactobacillus 
reuteri DPC16 supernatants against selected 
food borne pathogens. World Journal of 
Microbiology and Biotechnology (Impact 
Factor: 1.78). 04/2011; 27(4):991-998.
Nirunya, B., C. Suphitchaya and H. Tipparat, 
2008. Screening of lactic acid bacteria from 
gastrointestinal tracts of marine fish for their 
potential use as probiotics. Songklanakarin 
J. Sci. Technol.30 (Suppl.1), 141-148, April 
2008.
66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
SCREENING OF LATIC ACID BACTERIA FOR THEIR 
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST Aeromonas hydrophila 
CAUSING HEMORRHAGIC DISEASE IN TRA CATFISH 
(Pangasianodon hypophthalmus)
Tran Thi Ngoc Phuong1*, Dang Thi Hoang Oanh1
ABSTRACT
The research was conduted to isolate acid lactic bacteria from the gastroinstestinal tracts of wild 
freshwater catfish and then screen for their antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila 
causing Hemorrhagic disease in cultured Tra catfish. As the result, 96 strains of lactic acid bac-
teria which had inhibitory activity against indicator bacteria Escherichia coli were selected with 
29 strains isolated from stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24 
strains from Mystus nemurus (Valenciennes, 1839), 21 strains from Pangasius larnaudii (Bocourt, 
1866), 12 strains from Clarias macrocephalus (Gunther, 1864) and 8 strains from Pangasius larn-
audii (Bocourt, 1866). The result of Gram staining and biochemical characteristic tests illustrated 
most of selected strains of lactic acid bacteria were Gram-positive; nonsporulating; spherical, oval, 
short rod or long rod shape; negative oxidase and negative catalase. The result of antagonistic activ-
ity determination indicated that 46 LAB strains exhibited their inhibitory activity and three of them 
presented the ability to produce bacteriocin-like substances.
Keywords: Aeromonas hydrophila, antimicrobial activity, lactic acid bacteria, probiotic.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 25/11/2016
Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016
Ngày duyệt đăng: 05/01/2017
1 College of Aquacutulre and Fisheries, Cantho University.
* Email: phuongb1206814@student.ctu.edu.vn