Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi

chọn lọc 
cho thấy các chủng đều có khả năng biểu 
hiện protein VP28 – đều cho 1 vạch rõ ở kích 
thước khoảng 30 kDatrên bản gel SDS-PAGE 
và Western blot (Hình 4). Kích thước vạch 
protein của chủng nấm men không khác nhau 
rõ rệt trên bản gel SDS-PAGE; song vạch thể 
hiện protein VP28 được quan sát thấy rõ ở 
các chủng 11, 42 và 147 trên bản gel Western-
blot. Từ kết quả này, chủng 11 được chọn để 
nghiên cứu tiếp theo.
Hình 4: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 trong 9 chủng nấm men chọn lọc
M1: Thang protein Bio basic BSM0671; M2: PageRuler #26619
ĐC, 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147: chủng đối chứng, chủng 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147
25kDa3
82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Lượng protein VP28 được chủng 11 biểu 
hiện theo thời gian được xác định theo thời gian 
sau kích thích biểu hiện: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 
và 84 giờ. Kết quả cho thấy lượng protein VP28 
được tạo ra tăng dần theo thời gian kích thích; 
lượng protein cao nhất đạt tại 84 giờ (Hình 5). 
Hình 5: Sự hiện diện của protein VP28 theo 
thời gian trong xác tế bào nấm men chủng 11
M: Thang PageRuler #26619
ĐC: chủng đối chứng ở 84 giờ 
0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 chủng 11 ở các giờ 0, 
12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 sau biểu hiện
IV. THẢO LUẬN
Việc sử dụng tế bào nấm men để sản xuất 
vaccine phòng bệnh cho động vật trên cạn đã 
được nghiên cứu rộng rãi như bệnh Gumboro 
trên gà (infectious bursal disease), dịch tiêu 
chảy cấp trên lợn (porcine epidemic diarrhea), 
bệnh sốt lợn cổ điển (classical swine fever), 
bệnh do virus viêm gan B trên người,(Eda 
Celik và Pinar Calik, 2012; Rabert et al., 2013; 
Shin và Yoo, 2013); tuy nhiên ứng dụng này còn 
chưa được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy 
sản, đặc biệt là trong việc chế tạo vaccine phòng 
bệnh cho tôm nuôi. Hiện nay, mới chỉ có hai 
nhóm nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men P. 
pastoris để dòng hóa gen mã hóa protein vỏ: 
VP19, VP28, VP26 (Jha et al., 2007; Jha et al., 
2006a; Wang, 2009), VP37 (Liu et al., 2006), 
và protein PmRab7 – a shrimp WSSV-binding 
protein - (Jupatanakul et al., 2010) trong phòng 
bệnh đốm trắng cho crayfish và tôm nuôi.
Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protein 
vỏ VP 28 đã được dòng hóa vào tế bào nấm men 
và việc sàng lọc 150 chủng nấm men từ 03 đợt 
dòng hóa khác nhau đã cho 9 chủng có biểu 
hiện protein VP28 tốt trong tế bào. Chín chủng 
này đều cho vạch protein đặc hiệu cho VP28 
ở khoảng 30 kDa trên bản gel SDS-PAGE và 
Western-blot. Kết quả này tương tự như kết quả 
của Wang (2009) khi tác giả đã xác định được 
vạch khoảng 30 kDa trên bản gel của các dòng 
nấm men P.pastoris có chứa gen mã hóa protein 
vỏ VP28. Trong khi đó Jha et al., (2007) lại 
xác định được vạch ở vị trí 35 kDa trên bản gel 
phân tách protein của SDS-PAGE và Western-
blot. Sự khác biệt về giá trị trọng lượng thực 
của protein (28 kDa) và giá trị được xác định 
(30 kDa, hoặc 35 kDa) có thể do việc gắn thêm 
các nucleotide mã hóa các axit amin của histaq 
hoặc do quá trình đường hóa (glycosylation) 
hay phospo hóa (phosphorylation) – những hiện 
tượng thường gặp khi sử dụng tế bào nấm men 
làm hệ thống biểu hiện. 
Kết quả biểu hiện protein của các chủng 
nấm men chọn lọc đã cho thấy chủng 11 có tốc 
độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào lớn 
trong thời gian ngắn. Cụ thể, ở điều kiện 280C, 
nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 
vòng.phút-1, chủng nấm men 11, nuôi cấy trong 
erlen 500 ml đạt mật độ tế bào tối đa tại 84 giờ 
sau kích thích biểu hiện. Trong các trường hợp 
nuôi cấy trong nồi lên men ở tốc độ khuấy tương 
tự (250 vòng/phút), tốc độ sinh trưởng của nấm 
men nhanh hơn, đạt mật độ tế bào tối đa ở 72 
giờ (Asada et al., 2011; Cai et al., 2014). Trong 
phần lớn các nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng 
của nấm men, tốc độ sinh trưởng của nấm men 
được tính toán dựa trên giá trị OD600 của dung 
dịch nuôi cấy theo thời gian; trong nghiên cứu 
này giá trị OD600 của các chủng cũng được xác 
định (không trình bày trong bài) nhưng không 
tìm thấy sự sai khác giữa các chủng nghiên cứu, 
83TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
vì vậy tốc độ tăng trưởng được xác định bằng 
cách đếm trực tiếp khuẩn lạc nấm men thông qua 
phương pháp trang đĩa dịch nuôi cấy ở các nồng 
độ pha loãng khác nhau. Hơn thế nữa, phần lớn 
các tài liệu đều xác định việc tăng trưởng của 
chủng nấm men sau dòng hóa trong điều kiện 
sử dụng nồi lên men trong khi nghiên cứu này 
được tiến hành trên erlen 500 ml nên một số yếu 
tố môi trường như pH, nồng độ methanol, hàm 
lượng oxy không được kiểm soát chặt chẽ, 
do đó có thể làm ảnh hưởng đến mật độ tế bào 
cũng như làm giảm khả năng biểu hiện protein 
của dòng nấm men. Đó có thể là các lý do khiến 
mật độ tế bào nấm men cao nhất mà nghiên cứu 
này tìm được (3,92x109 tế bào/ml) khác với mật 
độ nấm men ở các nghiên cứu khác – như 2,4 x 
109 tế bào/ml với chủng nấm men chứa gen quy 
định protein CHRM2 (Asada et al., 2011).
Theo các nhà nghiên cứu, ngoài tốc độ lắc, 
nhiều yếu tố khác nữa có thể ảnh hưởng đến việc 
biểu hiện protein ở nấm men P. pastoris như pH, 
nhiệt độ, nồng độ methanol, thành phần trung 
bình hoặc các chất phụ gia (axit casamino, 
sorbitol, EDTA), (Peng et al., 2011; Rabert 
et al., 2013; Shi et al., 2003). Song, trong điều 
kiện thực tế của phòng thí nghiệm, các nghiên 
cứu về ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả 
năng lên men của chủng nấm men chọn lọc còn 
chưa được thực hiện.
KẾT LUẬN
Chủng nấm men P. pastoris GS115 số 11 
có tốc độ sinh trưởng nhanh cho 3,92x109 tế 
bào/ml sau 84 giờ kích thích biểu hiện ở điều 
kiện lên men trong bình lắc ở 280C, nồng độ 
methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng/
phút đã được chọn lọc từ 150 chủng nấm men 
sau dòng hóa. Đây cũng là chủng có khả năng 
biểu hiện protein VP28 tốt nhất – kết quả chạy 
điện di phân tách protein trên SDS-PAGE và 
kết quả phân tích Western-blot bằng kháng thể 
đặc hiệu của VP28 cho vạch rõ ở khoảng 30 
kDa. Chủng này được chọn làm nguyên liệu 
điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm 
trắng cho tôm nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., 
Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., 
Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., 
Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T., 
2011. Evaluation of the Pichia pastoris expression 
system for the production of GPCRs for structural 
analysis. Microbial Cell Factories 10.
Balamurugan, V., Reddy, G.R., Suryanarayana, V.V.S., 
2007. Pichia pastoris: A notable heterologous 
expression system for the production offoreign 
proteins—Vaccines Indian J. Biotechnol. 6, 175-
186 
Cai, F., Li, T., Xie, Y., He, X., 2014. Expression of 
functional single-chain variable domain fragment 
(scFv) antibody against Metolcarb in Pichia 
pastoris. Annals of Microbiology 64, 589-597.
Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, 
H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., 
2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus 
(Marsupenaeus) japonicus from white spot 
syndrome disease after oral administration of 
recombinant VP28 expressed in Brevibacillus 
brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.
Eda Celik, Pinar Calik, 2012. Production of recombinant 
proteins by yeast cells. Biotechnology Advances 
30, 1108-1118.
Fu, L.L., Wang, Y.B., Wu, Z.C., Li, W.F., 2011. In vivo 
assessment for oral delivery of Bacillus subtilis 
harboring a viral protein (VP28) against white 
spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei. 
Aquaculture 322, 33-38.
84 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hansson, M., Nygren, P., Stahl, S., 2000. Design and 
production of recombinant sub-unit vaccines. 
Biotechnology and Applied Biochemistry 32, 95-
107.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen, 
J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against 
white spot syndrome virus using recombinant 
oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish & 
Shellfish Immunology 22, 295-307.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of 
Procambarus clarkii against white spot syndrome 
virus using recombinant subunit injection vaccine 
expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72, 
1011-1019.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, 
W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines 
against white spot syndrome virus in Procambarus 
clarkii. Immunology Letters 105, 68-76.
Jupatanakul, N., Wannapapho, W., Eurwilaichitr, L., 
Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2010. Cloning 
and expression of recombinant shrimp PmRab7 (a 
virus-binding protein) in Pichia pastoris. Protein 
Expr. Purif. 76, 1-6.
Kim, C.S., Kosuke, Z., Nam, Y.K., Kim, S.K., Kim, 
K.H., 2007. Protection of shrimp (Penaeus 
chinensis) against white spot syndrome virus 
(WSSV) challenge by double-stranded RNA. Fish 
& Shellfish Immunology 23, 242-246.
Kumar, S.R., Ahamed, V.P.I., Sarathi, M., Basha, 
A.N., Hameed, A.S.S., 2008. Immunological 
responses of Penaeus monodon to DNA vaccine 
and its efficacy to protect shrimp against white 
spot syndrome virus (WSSV). Fish & Shellfish 
Immunology 24, 467-478.
Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K., 
Suzara, V.V., Duzgunes, N., Renugopalakrishnan, 
V., 2007. Expression of recombinant proteins in 
Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142, 
105-124.
Liu, Q.H., Huang, J., Han, W.J., Liang, Y., Lu, C.L., 
Wang, Q.Y., 2006. Expression, purification 
and characterization of WSSV-VP37 in Pichia 
pastoris. Aquaculture 258, 55-62.
Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I., 
Wada, S., Hatai, K., Inagawa, H., Takahashi, Y., 
Yoshimura, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Aoki, T., 
2010. The effect of liposome-coated recombinant 
protein VP28 against white spot syndrome virus in 
kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Journal 
of Fish Diseases 33, 69-74.
Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa, 
T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004. 
Vaccination trials with Penaeus japonicus to 
induce resistance to white spot syndrome virus. 
Aquaculture 229, 25-35.
Ning, D., Leng, X., Li, Q., Xu, W., 2011. Surface-
displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce 
protection against white spot syndrome virus in 
crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol. 
111, 1327-1336.
Peng, H., Liu, H.P., Chen, B., Hao, H., Wang, K.J., 
2011. Optimized production of scygonadin in 
Pichia pastoris and analysis of its antimicrobial 
and antiviral activities. Protein Expr. Purif. 82, 
37-44.
Rabert, C., Weinacker, D., Pessoa Jr, A., FarÃas, J.G., 
2013. Recombinants proteins for industrial uses: 
Utilization of Pichia pastoris expression system. 
Braz. J. Microbiol. 44, 351-356.
Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V., 
2007. DNA vaccines encoding viral envelope 
proteins confer protective immunity against 
WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 2778-
2786.
 Musthaq S Syed, Jimmy Kwang., 2011. Oral 
Vaccination of Baculovirus-Expressed VP28 
Displays Enhanced Protection against White Spot 
Syndrome Virus in Penaeus monodon. PLoS ONE 
6.
Sarathi, M., Simon, M.C., Venkatesan, C., Hameed, 
A.S.S., 2008. Oral administration of bacterially 
expressed VP28dsRNA to protect Penaeus 
monodon from white spot syndrome virus. Marine 
Biotechnology 10, 242-249.
Satoh, J., Kim, H.J., Matsui, T., Nishizawa, T., 
Optimization of WSSV rVP Expression in E. 
85TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
coli Cells and Minimum Dose of rVPs for Oral 
Vaccination in Kuruma Shrimp. Fish Pathology 
45, 169-174.
Shi, X., Karkut, T., Chamankhah, M., Alting-Mees, M., 
Hemmingsen, S.M., Hegedus, D., 2003. Optimal 
conditions for the expression of a single-chain 
antibody (scFv) gene in Pichia pastoris. Protein 
Expr. Purif. 28, 321-330.
Shin, M.K., Yoo, H.S., 2013. Animal vaccines based 
on orally presented yeast recombinants. Vaccine 
31, 4287-4292.
Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005. 
Fenneropenaeus indicus is protected from white 
spot disease by oral administration of inactivated 
white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic 
Organisms 66, 265-270.
Wang, L., 2009. Cloning of Envelope Protein Genes 
vp26 and vp28 of Shrimp White Spot Syndrome 
Virus (WSSV) and the Expressions in Pichia 
Pastoris. Master’s thesis, Jimei University. China.
Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten, 
M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon 
against white spot syndrome virus by oral 
vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061.
Witteveldt, J., Vlak, J.A., Van Hulten, M.C.W., 2004b. 
Protection of penaeus monodon against white spot 
syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. 
Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579.
Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006. 
Increased tolerance of Litopenaeus vannamei 
to white spot syndrome virus (WSSV) infection 
after oral application of the viral envelope protein 
VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167-
170.
86 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2. 
* Email: thuyngo8@yahoo.com
scReening sUiTable Pichia PasToRis sTRains caRRied VP28 gene 
To PRodUce ToleRine againsT WhiTe sPoT disease in shRimP
Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Dang Thi Tra My1
ABSTRACT
The use of Pichia pastoris as the expression system to produce recombinant proteins for disease 
prevention in inverterbrate has been published widely; however, it has been limited used in aqua-
culture, especially in preventation of shrimp diseases. This study is aimed to find a suitable strain 
from 150 strains of P. pastoris carrying pPick9K-VP28 vectors to produce tolerine against white 
spot disease in shrimp. Those strains were screened based on the phenotype (Mut+), copy number 
of VP 28 gene, the ability to express VP28 protein and growth rate of yeast strains. The selection 
process figured 125 strains of phenotype Mut+, in which, 82 strains have got 14-16 copy gene of 
VP28-His in genome. Further screening showed that recombinant VP28 protein was well expressed 
in 8 P.pastoris strains; the expressing protein was given a clear specific band of about 30kDa on 
SDS-PAGE gel and Western-blot cellulose membrane. Finally, one strain – strain 11 – revealed 
quick growth with the highest cell density of 3.92 x 109cfu/ml at 84 hours post stimulation and ef-
fectively expressed rVP28 the protein was selected to produce tolerine against white spot disease 
in future studies. 
Keywords: VP28, Pichia pastoris, White spot disease.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015
Ngày duyệt đăng: 15/6/2015