Quy trình phân tích đoạn cytochrome B trên các mẫu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

ụng BLAST để so sánh trình tự được đưa vào 
cơ sở dữ liệu của trình tự đáp ứng công ước 
quốc tế dựa vào tiêu chuẩn cho mã vạch DNA 
Cytochrome b
Bước 2: Chọn “BLAST” từ menu ở phía 
phải của trang chủ để thực hiện bước tìm kiếm 
dữ liệu và gióng hàng với trình tự gốc của dữ 
liệu NCBI 
Bước 3: Chọn “Nucleotide Blast” từ màn 
hình chính của BLAST (Hình 2.)
Hình 2: Màn hình chính của phần mềm BLAST, NCBI
23TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bước 4: Dán chuỗi trình tự vào mục “Enter 
query sequence in fasta format” và kích “BLAST”. 
Bước 5: Nhìn vào kết quả tìm kiếm NCBI cho 
biết những loài gì được tìm thấy gần nhất với 
đoạn trình tự được tra tìm. Kết quả cho biết 
về Mức độ bao phủ (Query cover), mức tương 
đồng (Identification) với loài gần nhất
Bước 6: Kích vào nút “Taxonomy reports 
” và “Distance tree of results”trên trang web 
để xem báo cáo về phân loại và cây phát sinh 
chủng loại mà cơ sở dữ liệu NCBI xây dựng.
2.2.8. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên 
cứu và xác định giá trị quan hệ loài
 Dữ liệu trình tự Cytochrome b của cả mẫu 
mới giải mã và dữ liệu có sẵn trong ngân hàng 
gen sẽ được chuẩn bị để phân tích khoảng các 
di truyền giữa các mẫu bằng cách sử dụng 
phần mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura và 
ctv., 2007). Sử dụng phương pháp Neighbour-
joining (NJ) và mô hình khoảng cách Kimura 
2-Parameter (K2P) (Kimura, 1980) có trong 
phần mềm MEGA để xây dựng cây phát sinh 
chủng loại của Cytochrome b. Với bộ dữ liệu 
gốc, bootstrap 1000 lần được thực hiện nhằm 
đánh giá độ tin cậy của sự phân nhánh trên 
các cây phát sinh chủng loại NJ. Các chỉ số 
về sự khác biệt trong cùng loài và cùng giống 
(conspecific and congeneric divergences) sẽ 
được tính toán. Các dữ liệu được phân nhóm 
(putative species clusters) dựạ vào cây phát 
sinh chủng loại NJ. Các nhóm được cho là 
cùng loài khi có độ chênh lệch hay khác biệt 
dưới 2%.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
Để thử nghiệm qui trình tách chiết DNA, 
chúng tôi tiến hành tách trên 7 mẫu vây cá Tra 
thu được ở Long Xuyên, tỉnh An Giang. 
Hình 3. Kết quả kiểm tra chất lượng 
DNA bằng gel agarose 
Dựa vào kết quả trên Hình 3, cho thấy DNA 
tách chiết được với hàm lượng lớn, không bị đứt 
gãy, sạch và ít bị nhiễm RNA. Ngoài ra, chúng 
tôi dùng máy đo Nanodrop để kiểm tra một cách 
chính xác hàm lượng và mức độ tinh sạch cua 
sản phẩm DNA (Bảng 2).
Bảng 2. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng 
máy đo nồng độ Nanodrop
Từ kết quả trên ở Bảng 2 cho thấy hàm 
lượng DNA thu được tương đối cao và chỉ số 
OD 260/280 điều nhỏ hơn 1,8. Điều này cho 
thấy phương pháp tách chiết DNA bằng tủa 
muối hoàn toàn thích hợp cho nghiên cứu của 
đề tài. 
3.2. Phản ứng PCR
3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR
Từ kết quả điện di trên gel agarose (Hình 4) 
cho thấy sản phẩm PCR nằm trong khoảng 430 
bp. Sản phẩm PCR tốt ở tất cả hầu hết nhiệt độ 
lai. Do đó, nhiệt độ Ta thích hợp cho phản ứng 
khuếch đại sẽ được lựa chọn theo công bố của 
tác giả 52,6oC.
24 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 4. Kết quả tối ưu mồi cytb
3.2.2. Kết quả phản ứng PCR
Hình 5. Kết quả chạy PCR với cặp mồi cytochrome b. 
Kết quả PCR trên một số mẫu cá Tra ngẫu 
nhiên (Hình 5) cho thấy quy trình chạy của tác 
giả cũng hoàn toàn thích hợp cho điều kiện 
phòng thí nghiệm của đề tài mặc dù sản phẩm 
DNA khuyếch đại có hàm lượng hơi thấp. Tuy 
nhiên, điều này sẽ được điều chỉnh khi tĕng hàm 
lượng DNA đầu vào cho phản ứng PCR.
3.3. Phân tích và sắp xếp trình tự bằng 
phần mềm FinchTV
Trình tự nhận được từ công ty First BASE 
Laboratories, Malaysia có 2 file với hai đuôi 
AB1 và SEQ, dùng file đuôi AB1 cho phần 
mềm FinchTV. 
Từ màn hình chính (Hình 6), nhập “Open” để 
nhập đoạn trình tự mong muốn kiểm tra chất 
lượng giải trình tự với đuôi file .AB1. 
Hình 6. Màn hình chính của phần mềm FinchTV
25TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 7. Kết quả kiểm tra chất lượng giải trình tự của sản phẩm
Theo quy ước, mỗi một màu chỉ thị cho một 
loại nucleotide, trong đó Adenine (A) = Xanh 
lá cây, Thymine (T) = đỏ, Cytosine (C) = Xanh 
dương, Guanine (G) = Đen (Hình 7). Từ kết 
quả cho thấy, tín hiệu đọc của mỗi nucleotide 
rõ ràng và tách biệt chứng tỏ kết quả đọc chính 
xác, rõ ràng, không bị tạp nhiễm. Ngoài ra, giá 
trị của chất lượng giải trình tự (Quality values) 
còn được thể hiện khi nhấp vào biểu tượng có 
hình “Q” trên menu. Sau đó, khi nhấp chuột vào 
một nucleotide nào đó, ở góc dưới cùng bên trái 
sẽ hiện ra giá trị Q và vị trí của nucleotide. Ví 
dụ, khi nhấp chuột vào nucleotide ở vị trí thứ 
428, giái trị Q được hiển thị là Q(10), điều này 
có nghĩa là có nghĩa là nucleotide thứ 428 sẽ 
có xác suất đọc sai là 1/10. Khi giá trị Q này 
nằm ở 30 hoặc cao hơn thì việc đọc nucleotide 
ở vị trí đó được xem là chính xác. Ngoài ra, khi 
gióng hàng mồi xuôi và mồi ngược, nếu có sự 
sai khác giữa hai trình tự thì nucleotide sẽ được 
chọn dựa vào giá trị Q. Dựa vào giá trị Q của 
FinchTV, chúng ta sẽ biết được bắt đầu vị trí 
nào sẽ bị cắt bỏ trong đoạn trình tự bằng phần 
mềm Bioedit nhầm loại bỏ đi đoạn mồi được 
gắn vào trong qua trình giải trình tự. Đối với 
dữ liệu nhiều chuỗi trình tự, các trình tự này sẽ 
được gióng hàng, cắt bỏ hai đầu cho bằng nhau 
và save lại ở một file dạng fasta chuẩn bị cho 
việc phân tích sau này. 
3.4. Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu 
trên NCBI
Những đoạn trình tự sau khi xử lý hoàn 
chỉnh, được sử dụng để so sánh với trình tự dữ 
liệu trên NCBI. Các thao tác được thực hiện 
như sau: dán chuỗi trình tự muốn so sánh vào 
ô “Enter query sequence”, Chọn “Pangasiidae” 
trong ô Organism và nhấn nút BLAST (Hình 8).
Hình 8. Màn hình chính của phần mềm BLAST
26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Kết quả được thể hiện như Hình 9.
Thông qua phần mềm BLAST, kết quả 
(Hình 9) cho thấy sự tương đồng cao (99% -100 
%) của các trình tự nucleotide gen Cytochrome 
b của mẫu cá Tra trong nghiên cứu với trình tự 
nucleotide của loài đã được công bố trên ngân 
hàng gen NCBI. Từ đây, có thể kết luận kết 
quả định danh bằng chỉ thị sinh học phân tử 
cytochrome b có trùng khớp với kết quả định 
danh bằng hình thái hay không và từ đó đưa ra 
mức độ chính xác của phương pháp sinh học 
phân tử. Bước phân tích này cũng được ứng 
dụng việc kiểm định loài trong các thực phẩm 
chế biến, việc này nhằm xác định sản phẩm 
này có nguồn gốc từ các Tra hay từ các loài 
cá khác. 
3.5. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên 
cứu và xác định giá trị quan hệ loài bằng 
phần mềm Mega 6
Các bước để tiến hành phân tích và vẽ cây 
phát sinh chủng loại gồm có:
1. Xác định mục tiêu, lấy mẫu sinh vật và 
họ gene;
Hình 9. Kết quả so sánh trình tự của mẫu với dữ liệu trên NCBI của phần mềm BLAST
27TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 10. Màng hình chính cho Aligment của Mega 6
2. Chọn marker phân tử, tức gene hay 
protein cần đọc trình tự; 
3. Đọc trình tự, hiệu chỉnh trình tự;
4. Sắp xếp thẳng hàng các trình tự;
5. Chọn mô hình tiến hóa;
6. Phân tích sự phát sinh chủng loài;
7. Đọc cây tiến hóa;
8. Kiểm tra cây tiến hóa;
9. Chấp nhận kết quả hoặc quay lại bước 2.
Từ phầm mềm Bioedit, các bước từ 1 đến 4 
sẽ được thực hiện, trong đó, các trình tự muốn 
nghiên cứu sẽ được gióng hàng và lưu trữ trên 
một file dữ liệu với đuôi được lưu là .fasta để 
chuẩn bị cho việc phân tích trong phần mềm 
Mega 6. Phần mềm Mega 6 là phần mềm phổ 
biến được sử dụng rộng rãi trong việc xử lý kết 
quả giải trình tự của các mẫu nghiên cứu.
Sau đó, bước 5 và 6 sẽ được thực hiện với 
phần mềm Mega 6. Trong phần mềm này, cây 
phát sinh loài sẽ được thiết lập bằng chức nĕng 
Phylogeny (Hình 11). Trong Phylogeny, chọn 
phương pháp Test Neighbor-Joining Tree (NJ). 
Phương pháp neighbor-joining (NJ) có mô hình 
tiến hóa là một hàm hiện. Trong phương pháp 
này từng cặp trình tự một sẽ được so sánh thẳng 
hàng cặp đôi và ứng với từng cặp, khoảng cách 
di truyền sẽ được tính toán. Do mô hình tiến 
hóa là một hàm hiện nên một trong số mô hình 
tiến hóa có thể được chọn để tính toán khoảng 
cách di truyền giữa từng cặp taxa từ đó cho ra 
một ma trận khoảng cách giữa tất cả các taxa. 
Do phương pháp neighbor-joining mà một 
trong những phương pháp nhanh nhất để dò tìm 
cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để 
phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa. Đồng 
thời, trong phương pháp này sẽ chọn phân tích 
bootstrap 1000 lần lặp lại. Phân tích bootstrap 
được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và 
độ tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa. 
Đầu tiên, các vị trí từ chuỗi trình tự đã sắp xếp 
thẳng hàng sẽ được đảo chỗ cho nhau một cách 
ngẫu nhiên để tạo ra nhiều mẫu phụ (gọi là sự 
lặp lại bootstrap). Như vậy các mẫu phụ có kích 
28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
thước giống như mẫu gốc nhưng vị trí thành 
phần không giống nhau. Sau đó các mẫu phụ sẽ 
được trải qua quá trình phân tích tương tự như 
mẫu gốc đã trải qua. Kết quả từ những mẫu phụ 
sẽ được dùng để tính toán giá trị support (ủng 
hộ) cho một nhánh đơn lẻ nào đó. Do giá trị 
support được biểu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất 
phải có 100 lần lặp lại, tức 100 lần tạo mẫu phụ. 
Thông thường thì người ta làm với 1.000 lần lặp 
lại để đạt được mức độ tin cậy cần thiết.
Hình 11. Màn hình của phần mềm Phylogeny
Dựa vào kết quả từ cây tiến hóa, chúng ta 
có thể xác định sự phát sinh chủng loại của các 
mẫu cần nghiên cứu dựa vào chỉ số được thể 
hiện trên từng nhánh cây. Ví dụ, theo hình 13, 
những mẫu cá dứa có mức độ khác biệt là 0 %, 
nhưng giữa các mẫu cá dứa và cá xác sọc là sự 
khác biệt này là 6,62 %. Điều này cho thấy hai 
loài này là hai loài khác nhau hoàn toàn do có 
độ chênh lệch hay khác biệt trên 2% (Hình 12).
Hình 12: Cây Neighbor-Joining (NJ) được xây dựng từ trình tự gen Cytochrome b của 9 mẫu cá 
nghiên cứu và trình tự của 2 loài: Pangasius macronema và Pangasius elongatus
29TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Ngay sau khi có kết quả cây tiến hóa, tiến 
hành thực hiện bước 7 đến bước 9, nhà nghiên 
cứu có thể so sánh kết quả với cây tiến hóa mà 
nhà nghiên cứu đã định nghĩa sẵn từ trước. Sự 
sai khác giữa hai cây tiến hóa này có thể giúp 
nhà nghiên cứu đi đến quyết định chấp nhận 
kết quả hay quay lại hiệu chỉnh. Sau khi có cây 
tiến hóa, nhà nghiên cứu có thể đưa cây tiến 
hóa vào những chương trình xử lý hình ảnh đồ 
hòa thông thường để hiệu chỉnh hay làm nổi 
bật nhóm lòai cần chú ý trước khi công bố.
Ngoài ra, Mega 6 cũng giúp tính toán 
khoảng cách di truyền của những loài nghiên 
cứu bằng chức nĕng Distance Compute 
pairwise distances dựa vào mô hình tính toán 
Kimura 2-Parameter (K2P). Kết quả nhận được 
như bảng 3, khoảng cách di truyền giữa các mẫu 
thuộc họ cá dứa và cá xác sọc là 0,137, kết quả 
này đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa hai loài 
này. 
Bảng 3: Khoảng cách di truyền của các mẫu thuộc 2 loài trong họ 
Pangasiidae: Pangasius macronema và Pangasius elongatus
IV. KẾT LUẬN
 Quy trình phân tích đoạn gien 
Cytochrome b hoàn toàn phù hợp với mục đích 
nghiên cứu kiểm định cá Tra. Các mẫu DNA sau 
khi được thực hiện phản ứng PCR đã tinh sạch 
và giải trình tự. Các trình tự sau khi nhận từ 
công ty giải trình tự đã được kiểm tra chất lượng 
và xử lý bằng kết hợp hai phần mềm FinchTV 
và Bioedit để đạt được trình tự chuẩn xác nhất 
cho các bước phân tích tiếp theo. Sau đó, phần 
mềm BLAST của dữ liệu NCBI đã so sánh và 
xác định mức độ tương đồng của mẫu nghiên 
cứu với trình tự mẫu, nếu kết quả thể hiện là 
99-100%, kết luận mẫu nghiên cứu có mức độ 
tương đồng cao với mẫu đã được công bố ở dữ 
liệu của NCBI. Cuối cùng, phần mềm Mega 6 
sẽ là phần mềm thích hợp cho các phân tích về 
sự phát sinh loài và khoảng cách di truyền giữa 
cá Tra và những loài cá da trơn khác trong họ 
Pangasiidae.
30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., 
deWaard, J.R., 2003. Biological identifications 
through DNA barcodes. Proceedings of the 
Royal Society of London. Series B: Biological 
Sciences 270, 313-321.
Kimura, M., 1980. A simple method for 
estimating evolutionary rate of base 
substitutions through comparative studies of 
nucleotide sequences. Journal of Molecular 
Evolution 16:111-120.
MRC, 2008. Mekong River Commission, Phnom 
Penh 
Puckridge, M., Andreakis, N., Appleyard, S.A., 
Ward, R.D., 2013. Cryptic diversity in flathead 
fishes (Scorpaeniformes: Platycephalidae) 
across the Indo-West Pacific uncovered by 
DNA barcoding. Molecular Ecology Resources 
13, 32-42.
Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S, 
2007. MEGA4: Molecular Evolutionary 
Genetics Analysis (MEGA) software version 
4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-
1599.
Sevilla R, Diez A, Noren M, 2007. Primers 
and polymerase chain reaction conditions 
for DNA barcoding teleost fish based on the 
mitochondrial cytochrome b and nuclear 
rhodopsin gienes. Mol Ecol Notes 7:730–734. 
Vences, M, 2005. Comparative performance of 
the 16S rRNA gene in DNA barcoding of of 
amphibians.
 (ngày 16/07/2016)
31TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
PROCESS OF ANALYSIS FOR CYTOCHROME B GEN 
ON TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) SAMPLES 
Tran Nguyen Ai Hang1*, Tran Thi Thuy Ha1
1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No.2
2 Research Institute for Aquaculture No.1
*Email: hangtna.ria2@mard.gov.vn
ABSTRACT
For identify Tra catfish (Pangasianodonhypoph-thalmus), process of analysis for cytochrome b gen 
was built. Using the universal primer for cytochrome b gen to amplify PCR products about 430 
bp for length from Tra catfish and other catfish samples belonging to Pangasidae. After cleaning 
process, products were sent to sequence. Before using for the analyzed steps, these sequences will 
be pre-treated to get the best sequences by two software such as FinchTV and Bioedit. Next, using 
BLAST to find a similarity with species was published in the database of NCBI. Finally, Mega 6 
software would be use to analyze genetic distance as well as building Neighbor-Joining tree subspe-
cies which also confirm close relationships between these species in the same family Pangasiidae. 
Keywords: Tra Catfish, Cytochrome b, Finch TV and Bioedit, Pangasianodon hypophthal-
mus, Mega 6. 
Người phản biện: ThS. Bùi Thị Liên Hà
Ngày nhận bài: 26/7/2016
Ngày thông qua phản biện: 10/8/2016
Ngày duyệt đĕng: 05/9/2016