Nghiên cứu điều kiện tối ưu nuôi cấy thu nhận bào tử Bacillus S5 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)

ch thích tạo bào tử của các 
ion kim loại Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ có xu hướng 
tăng dần khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha 
tăng trưởng đến pha ổn định. Tỷ lệ chuyển bào 
tử S5 cao nhất (93,09%) và có ý nghĩa khác biệt 
so với các ion kim loại khác và nghiệm thức đối 
chứng khi sử dụng ion Ca2+ bổ sung sau 30 giờ 
lên men. 
10 
Hình 2. Đường cong tăng trưởng của Bacillus S5 trong các môi trường nuôi cấy khác nhau 
3.4.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của khoáng đến sự hình thành bào tử của Bacillus S5 
Theo số liệu đường cong tăng trưởng của Bacillus S5 trong môi trường tối ưu, các mốc 
thời điểm bổ sung khoáng được chọn là 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha tăng 
trưởng, giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn định và giữa pha ổn định. 
Khả năng chuyển từ tế bào dinh dưỡng sang bào tử của chủng Bacillus S5 ảnh hưởng 
đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm bổ sung loại khoáng đó. Trong nghiệm thức đối 
chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%). Trong khi đó, 
khả năng kích thích tạo bào tử của các ion kim loại Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ có xu hướng tăng dần 
khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định. Tỷ lệ chuyển bào tử S5 cao 
nhất (93,09%) và có ý nghĩa khác biệt so với các ion kim loại khác và nghiệm thức đối chứng khi 
sử dụng ion Ca2+ bổ sung sau 30 giờ lên men. 
Bảng 6. Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các 
loại khoáng khác nhau. 
Thời điểm 
bổ sung 
khoáng 
(giờ) 
Danh 
mục 
khoáng 
Khảo sát sau 48 giờ 
Danh 
mục 
khoáng 
Khảo sát sau 48 giờ 
Tổng 
tế bào* 
Bào 
tử* 
Tỷ lệ 
bào tử 
(%) 
Tổng 
tế bào* 
Bào 
tử* 
Tỷ lệ 
bào tử 
(%) 
12 Fe
2+ 3,65 0,94 25,72 Ca2+ 3,00 1,00 33,27 
Mn2+ 2,69 0,50 18,58 Mg2+ 0.94 0,20 21,39 
21 Fe
2+ 3,24 0.90 27,77 Ca2+ 2,67 1,20 44,85 
Mn2+ 3,34 0.70 20,92 Mg2+ 1,67 0.67 40,00 
30 
Fe2+ 3,83 2,05 53,45 Ca2+ 3,11 2,90 93,09 
Mn2+ 3,66 1,09 29,78 Mg2+ 2,54 1,22 47,83 
36 
Fe2+ 3,43 2,55 74,23 Ca2+ 3,45 3,10 89,85 
Mn2+ 3,65 2,40 65,75 Mg2+ 3,24 2,05 63,27 
Đối chứng 3,85 1,30 33,80 
Ghi chú: *: x109 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu không bổ sung khoáng kích thích bào tử 
0
2
4
6
8
10
12
6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 30h 36h 42h 48hM
ậ
t 
đ
ộ
 q
u
a
n
g
 O
D
 5
5
0
n
m
Thời gian khảo sát
Môi trường tối ưu LB BHI NB
53TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bảng 6. Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các 
loại khoáng khác nhau.
Thời điểm 
bổ sung 
khoáng 
(giờ)
Danh 
mục 
khoáng
Khảo sát sau 48 giờ Danh 
mục 
khoáng
Khảo sát sau 48 giờ
Tổng tế 
bào*
Bào 
tử*
Tỷ lệ bào 
tử (%)
Tổng tế 
bào*
Bào 
tử*
Tỷ lệ bào 
tử (%)
12
Fe2+ 3,65 0,94 25,72 Ca2+ 3,00 1,00 33,27
Mn2+ 2,69 0,50 18,58 Mg2+ 0.94 0,20 21,39
21
Fe2+ 3,24 0.90 27,77 Ca2+ 2,67 1,20 44,85
Mn2+ 3,34 0.70 20,92 Mg2+ 1,67 0.67 40,00
30
Fe2+ 3,83 2,05 53,45 Ca2+ 3,11 2,90 93,09
Mn2+ 3,66 1,09 29,78 Mg2+ 2,54 1,22 47,83
36
Fe2+ 3,43 2,55 74,23 Ca2+ 3,45 3,10 89,85
Mn2+ 3,65 2,40 65,75 Mg2+ 3,24 2,05 63,27
Đối chứng 3,85 1,30 33,80
Ghi chú: *: x109 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu không bổ sung khoáng kích thích bào tử
IV. THẢO LUẬN
Các nghiên cứu về điều kiện môi trường lên 
men lên sinh khối của nhóm Bacillus đã được 
thực hiện bởi nhiều nhóm tác giả, trong đó Trần 
Vũ Đình Nguyên (2014) đã công bố mật độ tế 
bào của chủng Bacillus B3.10.2 bị ảnh hưởng 
bởi nguồn nitơ thử nghiệm như bột đậu nành, 
amoni sulfat, pepton. Trong đó, pepton được 
xem là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trưởng 
của Bacillus B3.10.2. Ngoài ra Bacillus B3.10.2 
còn phát triển tốt khi môi trường được cung cấp 
thêm nguồn glucose hoặc mật rỉ đường. Hơn nữa, 
Dong và ctv., (2010) đã tìm ra môi trường phù 
hợp đạt sinh khối cao của B. licheniformis khi 
sử dụng nguồn nitơ là pepton hoặc cao thịt bò và 
nguồn carbon là sucrose, glucose hoặc lactose. 
Có nhiều công trình nghiên cứu được thực 
hiện để tìm ra môi trường thích hợp tăng cường 
khả năng tạo bào tử của các chủng Bacillus. 
Trong đó đáng chú ý với hai công thức môi 
trường như sau: công thức 1 bao gồm 16,18 
g/L bột bắp, 17,53 g/L bột đậu nành và 8,14 g/L 
cao nấm men có khả năng tạo mật độ bào tử B. 
subtilis là 1,52x1010 CFU/mL sau 40 giờ (Chen 
và ctv., 2010); công thức 2 bao gồm bột vỏ quýt 
40g, pepton 8,0g, KH2PO4 1,0g, MgSO4
.7H2O 
0,5 g, polypropylene glycol 5 mL hòa tan trong 
1L nước bột phô mai và lên men sau 97 giờ đạt 
mật độ bào tử 6,5 x1010 CFU/mL (Khardziani 
và ctv., 2017). Ngoài ra, nồng độ glucose giữ 
vai trò quan trọng trong quá trình tạo bào tử của 
Bacillus. Nồng độ glucose trong môi trường 
lên men gia tăng là nguyên nhân dẫn đến giảm 
lượng bào tử Bacillus. Nồng độ glucose đạt 5 
g/L có thể tăng tế bào dinh dưỡng và bào tử 
B. subtilis MB 24. Mặt khác, nồng độ glucose 
tăng trên 5 g/L sẽ ức chế hiệu quả tạo bào tử 
của chúng (Monteiro và ctv., 2005, Khardziani 
và ctv., 2017). Tuy nhiên, trong thí nghiệm của 
chúng tôi, nồng độ glucose có mối tương quan 
thuận đến sinh khối của Bacillus S5 và lượng 
sinh khối này ảnh hưởng đến số lượng bào tử 
thu được sau thời gian lên men 48 giờ. 
Các ion kim loại giữ vai trò quan trọng 
trong việc hoạt hóa hệ thống enzyme cần thiết 
cho quá trình hình thành bào tử (Kolodziej và 
Slepecky, 1964). Ren và ctv., (2018) thử nghiệm 
trong sáu ion kim loại thì có ba ion Mn2+, Fe2+ 
và Ca2+ với nồng độ theo thứ tự 1,0 mM, 3,0 
mM, 2,1 mM tạo bào tử B. amyloliquefaciens 
với mật độ 8,05x109, cao gấp 8,8 lần so với môi 
trường không bổ sung các ion kim loại này. 
Ngoài ra, nghiên cứu của Phương Thị Hương 
và Vũ Văn Hạnh (2018) cho thấy với tỷ lệ cấp 
giống 7%, pH 7, nhiệt độ lên men 370C, tốc độ 
lắc 200 vòng/phút và thành phần môi trường 
54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
chứa 1,5% glucose, 1% pepton và Ca2+ 50 mM, 
sinh khối của chủng B. subtilis BSVN 15 đạt 
6,3 x 1011 CFU/mL. Tương tự trong nghiên 
cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv., (2018), môi 
trường thích hợp để sản xuất sinh khối của B. 
subtilis KP3 (4,46x109 CFU/mL) bao gồm 10 
g/L glucose, 19,75 g/L đậu không dầu, amoni 
citrate 1,7 g/L, mật rỉ 7,2 g/L, pepton từ thịt 
11,13 g/L, MnCl2 16,58 mM, KH2PO4 4,58 g/L, 
CaCl2 0,01 g/L, NaCl
 4,04 g/L, FeSO
4
.7H2O 1 
µM, MgSO
4
.7H2O 0,38 g/L, sau 8 giờ bổ sung 
CaCl2 0,5 g/L và FeSO4.7H2O 35 µM có khả 
năng kích thích mật độ bào tử tăng lên gấp 3 
lần. Ngoài ra, Yu và ctv., (1998) cho rằng mỗi 
loại vi khuẩn khác nhau sẽ thích hợp với tỷ lệ 
C/N trong môi trường sống nhất định 
Ion Ca2+ là thành phần chủ yếu của lõi bào 
tử và có khả năng gắn kết với thành phần đặc 
biệt bào tử gọi là DPA (dipicolinic acid) giúp 
bào tử có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao 
(Levinson và ctv., 1961). Ngoài ra, Ca2+ tương 
tác với các enzyme chịu trách nhiệm cho việc 
tạo ra các kết nối giữa các protein bề mặt với 
thành tế bào vi khuẩn, do đó ảnh hưởng đến khả 
năng bám dính của vi khuẩn (Thomas và Rice, 
2014). 
V. KẾT LUẬN
Trong điều kiện lên men quy mô phòng thí 
nghiệm thể tích 50mL, thành phần môi trường 
được lựa chọn nhằm tối ưu sinh khối của chủng 
Bacillus S5 đã được xây dựng theo mô hình 
Placket- Burman và phương pháp đáp ứng bề 
mặt RSM bao gồm bột đậu nành 34,9 g/L, cao 
nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L, tốc độ lắc 170 
vòng/phút, pH môi trường 7,0 và nhiệt độ lên 
men 300C, sau 48 giờ nuôi cấy giá trị OD
550nm
đạt 11,36 tương ứng với mật độ 4,3x109 CFU/
mL. Ngoài ra, bổ sung Ca2+ 0,5g/L sau 30 giờ 
lên men, tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 có khả 
năng chuyển 93% sang dạng bào tử. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông và Trần Thu 
Hoa, 2009. Công nghệ Sinh học Dược, NXB 
Giáo Dục.
Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018. Lựa 
chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng 
Bacillus subtilis BSVN 15 ứng dụng chế phẩm 
probiotic trong chăn nuôi, Tạp chí Công Nghệ 
Sinh học 16(1): 167-172V.
Võ Hồng Phượng, Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị 
Ngọc Tĩnh và Đặng Ngọc Thùy, 2018. Nghiên 
cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp. 
gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm 
thẻ chân trắng, Báo cáo tổng kết năm 2018.
Vũ Thanh Thảo, Phan Cảnh Trình, Nguyễn Thị Linh 
Giang, Lê Văn Thanh và Trần Cát Đông, 2018. 
Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử 
Bacillus subtilis KP3, Y học TpHCM, Phụ bản 
Tập 22(1): 453-459.
Tài liệu tiếng Anh
Bernlohr, R. W. và Leitzmann, C., 1969. Control of 
sporulation London: Academic Press.
Castillo E Del (2007), Process Optimization A 
Statistical Approach., Springer Science. New 
York, USA, 118-122.
Chen, Z. M., Li, Q., Liu, H. M., Yu, N., Xie, T. J., 
Yang, M. Y., Shen, P. và Chen, X. D., 2010. Greater 
enhancement of Bacillus subtilis spore yields in 
submerged cultures by optimization of medium 
composition through statistical experimental 
designs, Appl Microbiol Biotechnol, 85(5): 
1353-60.
 Duc, L. H., Hong, H. A., Barbosa, T. M., Henriques, 
A. O. và Cutting, S. M., 2004. Characterization 
of Bacillus probiotics available for human use, 
Applied and environmental microbiology, 70(4): 
2161-2171.
 Granger, A. C., Gaidamakova, E. K., Matrosova, V. 
Y., Daly, M. J. và Setlow, P., 2011. Effects of Mn 
and Fe levels on Bacillus subtilis spore resistance 
and effects of Mn2+, other divalent cations, 
orthophosphate, and dipicolinic acid on protein 
resistance to ionizing radiation, Appl Environ 
Microbiol, 77(1): 32-40.
Cho, J.-H., Kim, Y.-B. và Kim, E.-K., 2009. 
Optimization of culture media for Bacillus species 
by statistical experimental design methods.
55TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Dong, W., Zhang, D., Zhang, J., Li, H. và Jin, Y. 
Optimization of the Growth Culture Medium 
with Traditional Chinese Herbs and Conditions 
of Bacillus Licheniformis SH003. 2010 4th 
International Conference on Bioinformatics and 
Biomedical Engineering, 18-20 June 2010 2010. 
1-5.
Gauri, S. S., Mandal, S. M., Pati, B. R. và Dey, S., 
2011. Purification and structural characterization 
of a novel antibacterial peptide from Bellamya 
bengalensis: activity against ampicillin and 
chloramphenicol resistant Staphylococcus 
epidermidis, Peptides, 32(4): 691-6.
Grossman, A. D. và Losick, R., 1988. Extracellular 
control of spore formation in Bacillus subtilis, 
Proceedings of the National Academy of 
Sciences of the United States of America, 85(12): 
4369-4373.
Harwood, C. R., 1992. Bacillus subtilis and its 
relatives: molecular biological and industrial 
workhorses, Trends Biotechnol, 10(7): 247-56.
Khardziani, T., Kachlishvili, E., Sokhadze, K., 
Elisashvili, V., Weeks, R., Chikindas, M. L. và 
Chistyakov, V., 2017. Elucidation of Bacillus 
subtilis KATMIRA 1933 Potential for Spore 
Production in Submerged Fermentation of Plant 
Raw Materials, Probiotics Antimicrob Proteins, 
9(4): 435-443.
Kolodziej, B. J. và Slepecky, R. A., 1964. Trace 
Metal Requirements for Sporulation of Bacillus 
Megaterium, J Bacteriol, 88(821-30.
Levinson, H. S., Hyatt, M. T. và Moore, F. E., 
1961. Dependence of the heat resistance of 
bacterial spores on the calcium: Dipicolinic acid 
ratio, Biochemical and Biophysical Research 
Communications, 5(6): 417-421.
 Monteiro, S. M., Clemente, J. J., Henriques, A. 
O., Gomes, R. J., Carrondo, M. J. và Cunha, 
A. E., 2005. A procedure for high-yield spore 
production by Bacillus subtilis, Biotechnol Prog, 
21(4): 1026-31.
Nicholson, W. L. và Setlow, P., 1990. Sporulation, 
germination, and outgrowth, Chichester, 
England: John Wiley & Sons Ltd. .
Plackett, R. L. và Burman, J. P., 1946. The Design 
of Optimum Multifactorial Experiments, 
Biometrika.
Rao, Y., Tsay, K.-J., Wu, W.-S. và Tzeng, Y.-M., 
2007. Medium optimization of carbon and 
nitrogen sources for the production of spores 
from Bacillus amyloliquefaciens B128 using 
response surface methodology.
Ren, H., Su, Y. T. và Guo, X. H., 2018. Rapid 
optimization of spore production from Bacillus 
amyloliquefaciens in submerged cultures based 
on dipicolinic acid fluorimetry assay, AMB 
Express, 8(1): 21.
Schaeffer, P., Millet, J. và Aubert, J. P., 1965. 
Catabolic repression of bacterial sporulation, 
Proceedings of the National Academy of Sciences 
of the United States of America, 54(3): 704-711.
Thomas, K. J., 3rd và Rice, C. V., 2014. Revised 
model of calcium and magnesium binding to the 
bacterial cell wall, Biometals, 27(6): 1361-70.
Xiao, Z. J., Liu, P. H., Qin, J. Y. và Xu, P., 2007. 
Statistical optimization of medium components 
for enhanced acetoin production from molasses 
and soybean meal hydrolysate, Appl Microbiol 
Biotechnol, 74(1): 61-8.
Yu, X., G Hallett, S., Sheppard, J. và Watson, A., 
1998. Effects of carbon concentration and 
carbon-to-nitrogen ratio on growth, conidiation, 
spore germination and efficacy of the potential 
bioherbicide Colletotrichum coccodes.
56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
 FERMENTATION CONDITIONS FOR OPTIMIZATION OF SPORE 
PRODUCTION IN BACILLUS S5 USING RESPONSE SURFACE 
METHOD (RSM)
Vo Hong Phuong1*, Dang Ngoc Thuy1, Nguyen Thi Lan Chi1, Nguyen Thanh Truc1, 
Chu Quang Trong1, Pham Thi Huyen Dieu2
ABSTRACT
Bacillus S5 strain was isolated from the soil of an extensive shrimp pond which can inhibit V. 
parahaemolyticus causing AHPND in experimental conditions. This research aimed to determine 
the medium composition and fermentation parameters for the optimal growth and spore formation 
in Bacillus S5 strain which was proved to be a potential probiotic for aquaculture. The optical 
density (OD
550nm
) of culture suspension was the parameter that can be used to assess the effectiveness 
of fermentation conditions. Response surface method (RSM) was used to optimize the fermentation 
parameters. The results showed that the optimal fermentation medium for producing highest 
Bacillus S5 biomass after 48h (with OD
550nm
 value 11,36 which corresponded a density of 4.3 x 109 
CFU/mL) should have the following composition: soybean flour 34.9 g/L, yeast 20g/L, glucose 35 
g/L and shaking speed 170 rpm. In addition, 0.5 g/L of calcium ion added after 30h of fermentation 
can stimulate a spore-forming ratio of over 90%.
Keywords: Bacillus S5 biomass, Bacillus S5 spores, fermentation condition optimization. 
Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 20/5/2019
Ngày thông qua phản biện: 22/6/2019
Ngày duyệt đăng: 26/6/2019
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2.
2 HCMC University of Education.
*Email: vohongphuong@yahoo.com