Khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus NT7 phân lập từ tôm thẻ bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) của chủng Bacillus polyfermenticus F27 phân lập từ giun quế

24 giờ. 
Bằng phương pháp giếng khuếch tán, 
đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng 
thử nghiệm có giá trị từ 10,33 – 18,50mm (hình 
2). Trong đó, chủng Bacillus polyfermenticus 
F27 có đường kính lớn nhất và có ý nghĩa thống 
kê so với các chủng còn lại (18,50mm) (hình 3), 
tiếp theo là chủng B. subtilis Q16 (16,25mm). 
Chủng có đường kính vòng kháng nhỏ nhất là 
Bacillus sp. Q270 (10,33mm). Chúng tôi lựa 
chọn chủng B. polyfermenticus F27 để thực hiện 
các thí nghiệm tiếp theo. 
 Bằng phương pháp đồng nuôi cấy, ở 
nghiệm thức 4 (NT4) mật độ Vibrio thấp hơn 
so với đối chứng (NT1) chứng tỏ rằng chủng B. 
polyfermenticus F27 có thể ức chế lại V. 
parahaemolyticus NT7 khi ở cùng trong một 
điều kiện nuôi cấy (hình 4). Trong thử nghiệm 
này ta thấy rằng Vibrio bị ức chế mạnh nhất ở 
mật độ là 107 CFU/ml. 
Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của các chủng Bacillus thử nghiệm 
A B 
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 19 
Hình 3. Đường kính vòng kháng khuẩn của một số chủng thử nghiệm 
Tính an toàn của B. polyfermenticus F27 
Thử nghiệm khả năng gây dung huyết 
Chủng B. polyfermenticus F27 không có 
khả năng dung huyết, an toàn đối với tôm (kết 
quả không trình bày). 
Thử nghiệm đánh giá tính an toàn của 
Bacillus thử nghiệm trên tôm thẻ 
Tính an toàn của chủng B. polyfermenticus 
F27 lên tôm trưởng thành được thể hiện qua tỷ 
lệ sống không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê 
so với đối chứng (không bổ sung vi khuẩn) 
được ghi nhận ở Bảng 1. 
Bảng 1 
Kết quả thử nghiệm tính an toàn của chủng B. polyfermenticus F27 trên tôm 
 Nghiệm thức Liều thử nghiệm (CFU/ mL) Tổng con sống (con) Tỷ lệ Sống (%) 
Đối chứng (ĐC) 0 27,83 46,39 ± 5,88 ns 
B. polyfermenticus F27 10
6 21,67 36,11 ± 6,77 
Chú thích: ns: không có sự khác biệt ở mức P =0,05 
Khả năng gây chết trung bình - LD50 của V. parahaemolyticus NT7 lên tôm thẻ 
Chúng tôi khảo sát khả năng gây chết trung bình của V. parahaemolyticus NT7 lên tôm thẻ 1g 
(Bảng 2). 
Bảng 2 
Kết quả khả năng gây chết LD50 
Nghiệm 
thức 
Liều gây độc 
(CFU.ml-1) 
Tổng chết 
(con) 
Tổng 
sống (con) 
Tổng chết 
dồn (con) 
Tổng sống 
dồn (con) 
Tỷ lệ chết 
dồn (%) 
NT1 0 2 28 2 110 1.79 
NT2 1.103 3 27 5 82 5.75 
NT3 1.104 7 23 12 55 17.91 
NT4 1.105 8 22 20 22 47.62 
NT5 1.106 30 0 50 0 100.0 
PD 0,95 
LD50 1,12.105 
20 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 
Kết quả Bảng 2 cho thấy nghiệm thức NT1 
(đối chứng âm) không thấy biểu hiện tôm chết. 
Điều này chứng tỏ rằng tôm chết là do độc lực 
từ vi khuẩn gây ra. Dựa vào công thức tính 
LD50, nhận thấy rằng tỷ lệ chết 50% của tôm 
sau khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7 
là 1,12.105 CFU/ml. 
Khả năng bảo vệ tôm thẻ trong điều 
kiện cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7 
Với kết quả xác định liều gây độc (LD50) là 
1,12.105, chúng tôi thử nghiệm đánh giá hiệu quả 
kiểm soát sinh học của chủng B. polyfermenticus 
F27. Kết quả bảng 3 cho thấy nghiệm thức NT3, 
NT4 được bổ sung chủng B. polyfermenticus F27 
với các mật độ 106 và 107 CFU/mL trong điều 
kiện gây nhiễm vi khuẩn gây bệnh V. 
parahaemolyticus NT7 thì có tỷ lệ tôm sống cao 
hẳn hơn so với nghiệm thức NT1 chỉ bổ sung V. 
parahaemolyticus NT7 và có sự khác biệt có ý 
nghĩa (P < 0,05). RPS (%) của các nghiệm thức 
NT3, NT4 lần lượt là 66,7% và 76,19% cho thấy 
chủng vi khuẩn khảo sát có khả năng bảo vệ tôm 
gây nhiễm với V. parahaemolyticus NT7 khá 
cao ở mật độ 106 và 107 CFU/ mL. Từ kết quả 
trên, chủng B. polyfermenticus F27 đạt mật độ 
106 CFU/ml đã có khả năng bảo vệ tôm chống 
lại V. parahaemolyticus NT7 và đạt hiệu quả tốt 
hơn ở mật độ 107 CFU/ml.. 
Bảng 3 
Kết quả tỷ lệ sống (%) và RPS (%) khi gây nhiễm V. parahaemolyticus NT7 
Nghiệm thức Tỉ lệ sống (%) RPS (%) 
NT1 30,00 
NT2 93,33 
NT3 73,33 66,7 
NT4 83,33 76,19 
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ớ mức ý nghĩa P=0,05 qua 
phép thử Duncan. 
Đồng thời, trong thời gian thử nghiệm, 
chúng tôi kiểm tra mật độ V. parahaemolyticus 
ở các nghiệm thức. Nghiệm thức NT1 mật độ 
Vibrio luôn cao hơn so với NT3 và NT4. Điều 
này cho thấy chủng B. polyfermenticus F27 có 
khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus 
trên quy mô thực nghiệm (hình 4), giúp khẳng 
định lại khả năng ức chế của chủng B. 
polyfermenticus F27 ở mật độ 106 CFU/ml và 
ức chế cao ở mật độ 107 CFU/ml. 
Hình 4. Kết quả kiểm tra mật độ V. parahaemolyticus ở các nghiệm thức 
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 21 
4. Thảo luận 
Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus 
spp. đã cho thấy rằng chúng có thể làm giảm 
mật độ vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy 
sản. Như báo cáo của Vaseeharan, Ramasamy 
(2003) đã sử dụng Bacillus subtilis BT23 để 
kiểm soát V. harveyi. Nghiên cứu của Balcazar 
và Tyrone (2007) cũng cho thấy Bacillus 
subtilis UTM 126 có khả năng kiểm soát sinh 
học chủng V. parahaemolyticus (Balcazar và 
Tyrone, 2007). Nguyễn Văn Minh và cộng sự 
(2011) đã sử dụng 3 chủng vi khuẩn Bacillus 
spp. (F11, F33, F10) có khả năng kiểm soát sự 
tăng trưởng của 3 chủng vi khuẩn gây bệnh là 
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. 
harveyi ở mật độ Bacillus spp. tốt nhất là 109 
CFU/ml (Nguyễn Văn Minh và cs., 2011). Ở 
nghiên cứu này, chúng tôi chọn lọc được chủng 
B. polyfermenticus F27 có khả năng kháng V. 
parahaemolyticus NT7 cao nhất (18,50 mm). 
Ở thử nghiệm tính an toàn của chủng B. 
polyfermenticus F27 được đánh giá dựa trên 2 
thử nghiệm là khả năng huyết giải và tính an 
toàn đối với tôm. Thử nghiệm khả năng dung 
huyết là bước sàng lọc tính gây bệnh của các 
chủng để đảm bảo an toàn đối với động vật 
thủy sản và cho động vật có vú nói chung nhằm 
đảm bảo tính an toàn khi thực phẩm thủy sản 
bị nhiễm cho con người qua chuỗi thức ăn 
(Shafiqur, 2009). Trong nghiên cứu của 
Shafiqur (2009) về Bacillus spp. phân lập được 
từ ao tôm tỉ lệ dương tính hemolysin là 48,64%. 
Chủng B. polyfermenticus F27 được đánh giá an 
toàn đối với tôm nên được lựa chọn để tiến 
hành thử nghiệm tiếp theo. 
Nguyễn Văn Minh và cộng sự (2011) đã 
phân lập được 2 chủng Bacillus sp. F10 và F11 
từ giun quế có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú 
chống lại V. parahaemolyticus (Nguyễn Văn 
Minh và cs., 2011). “Kết quả của nghiên cứu thí 
nghiệm khả năng bảo vệ tôm giống trong điều 
kiện cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7 cho 
thấy B. polyfermenticus F27 có khả năng bảo vệ 
tôm giống”. 
5. Kết luận 
Hiện nay, tình trạng lạm dụng kháng sinh 
và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ngày càng 
gia tăng, làm tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh lẫn 
các vi khuẩn có lợi, gây ra tình trạng kháng 
thuốc và dư lượng kháng sinh và hóa chất còn 
gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức 
khỏe người sử dụng. Do đó kết quả của nghiên 
cứu này giúp mở ra một hướng phát triển mới 
cho ngành chế phẩm thủy sản - chế phẩm an 
toàn cho con người và không ảnh hưởng đến 
môi trường sinh thái. 
Chúng tôi đã phân lập được chủng V. 
parahaemolyticus NT7 từ mẫu tôm thẻ bệnh 
hoại tử gan tụy. Thử nghiệm khả năng đối 
kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc 
cho thấy có 9 trong số 25 chủng Bacillus kháng 
V. parahaemolyticus NT7. Trong đó, chủng B. 
polyfermenticus F27 phân lập từ giun quế có 
đường kính lớn nhất là 18,50 mm, khác biệt 
thống kê so với các chủng còn lại, có khả năng 
ức chế V. parahaemolyticus NT7 khi tiến hành 
đồng nuôi cấy, an toàn đối với tôm giống được 
lựa chọn cho những thử nghiệm tiếp theo. 
Đồng thời chứng minh được chủng B. 
polyfermenticus F27 có khả năng bảo vệ tôm thẻ 
chống lại V. parahaemolyticus gây bệnh trên mô 
hình gây nhiễm nhân tạo. Sau thời gian thử 
nghiệm, 93,33% tôm ở nghiệm thức đối chứng 
không bổ sung vi khuẩn (NT2) vẫn sống và hoạt 
động bình thường chứng tỏ các yếu tố môi trường 
không ảnh hưởng đến tôm. Bên cạnh đó, tôm 
chết ở các nghiệm thức đều có dấu hiệu của bệnh 
hoại tử gan tụy và phân lập được V. 
parahaemolyticus từ những mẫu này. Điều này 
chứng tỏ tôm ở các nghiệm thức chết là do V. 
parahaemolyticus. Số lượng tôm sống ở các 
nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa (P < 
0,05). Trong đó, các nghiệm thức NT3, NT4 bổ 
sung B. polyfermenticus F27 với mật độ 106 và 
107 CFU/ml có tỷ lệ sống cao hơn gấp 2,44 và 
2,78 lần so với nghiệm thức đối chứng NT1. RPS 
(%) của các nghiệm thức NT3, NT4 đều lớn hơn 
50% cho thấy khả năng bảo vệ tôm khá cao của 
chủng khảo sát. Kết quả của nghiên cứu này cho 
thấy chủng Bacillus polyfermenticus F27 có tiềm 
năng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học kiểm 
soát và phòng bệnh EMS/AHPNS trên tôm. 
22 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 
Tài liệu tham khảo 
Balcazar, J. L. & Rojas-Luna, T. (2007). Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126 
against Vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp (Litopenaeus 
vannamei). Curr Microbiol, 55(5), 409-412. 
Chythanya, R., Karunasagar, I. & Karunasagar, I. (2002). Inhibition of shrimp pathogenic vibrios 
by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture, 208, 1-10. 
Domorongpokkaphan, V. & Wanchaitanawong, P. (2006). In vitro Antimicrobial Activity of 
Bacillus spp. Against Pathogenic Vibrio spp. in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon). 
Kasetsart J., 40, 949-957. 
FAO (2013). Report of the FAO/MARD technical workshop on early mortality syndrome (EMS) 
or acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS) of cultured shrimp (under 
TCP/VIE/3304) Hanoi, Vietnam, on 25–27 June 2013. FAO Fisheries and Aquaculture 
Report No. 1053. 
 Flegel, T.W. (2012). Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. 
Journal of Invertebrate Pathology, 110, 166-173. 
Gatesoupe, F. J. (1999). The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 180, 147-165. 
Smibert, R.M. and Krieg, N.R. (1981) General Characterization. In: Gerdhardt, P., Murray, 
R.G.E., Costilow, R.N., Nester, E.W., Wood, W.A., Krieg, N.R. and Phillips, G.B., Eds., 
Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Microbiology, 
Washington, DC, 409-443. 
Han, J. E. et al. (2015). Plasmid mediated tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus 
associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimps. Aquaculture, 
2, 17-21. 
Holt, J. G. et al. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th edition, Chapper V, 
816 pages. 
Kondo, H. et al. (2014). Draft genome sequences of six strains of Vibrio parahaemolyticus Isolated 
from Early Mortality Syndrome/Acute Hepato- pancreatic Necrosis Disease shrimp in 
Thailand. Genome Announc, 2(2), (e00221-14). 
 Lightner, D.V. et al. (2013). Determination of the infectious nature of the agent of acute 
hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic 
Organisms, 105, 45-55. 
Lightner, D.V. et al. (2012). Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global Aquaculture 
Advocate, January/February, 40. 
MacFaddin, J.F. (2000). Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Edition, 
Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 
Mooney, A. (2012). An emerging shrimp disease in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? 
Available at:  (accessed 24 Feb 2012). 
Moriarty, D. J. W. (1997). The role of microorganisms in aquaculture ponds. Aquaculture, 151, 
333-349. 
NACA-FAO (Network of Aquaculture Centers in Asia-Pacific-Food and Agriculture Organization 
of the United Nations) (2011). Quarterly Aquatic Animal Disease Report (Asia and Pacific 
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 23 
Region), 2011/2, April–June 2011. NACA, Bangkok. 
Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, Đỗ Phương Quỳnh, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật 
Linh, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Lê Hồng Phước (2013). Khả năng kiểm soát sinh học 
Edwardsiella ictaluri gây bệnh của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ ao nuôi cá tra. 
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 51(5C), 508-512. 
Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đan Duy Pháp, Lai Phong Mỹ Lệ, Lại Thị Minh Lê, Nguyễn 
Thị Hồng Phương, , Phạm Hùng Vân (2010). Phân lập và sàng lọc một số vi khuẩn tiềm 
năng làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản từ trùn quế (Perionyx excavatus). Hội nghị 
CNSH thủy sản toàn quốc, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. 
Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đỗ Bảo Ngọc, Trần Thị Khánh Linh, Hà Thị Bảo Yến, 
Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2011). Nghiên cứu khả năng kiểm soát Vibrio 
spp. gây bệnh trên tôm sú của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ trùn quế. Tạp chí NN 
& PTNN, 137 -143. 
Purivirojkul, W. & Areechon, N. (2007). Application of Bacillus spp. isolated from the intestine 
of blacktiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habitat for control 
pathogenic bacteria in aquaculture. Kasetsart J. (Nat. Sci.) 41, 125-132. 
Shafiqur, R.et al. (2009) Application of probiotic bacteria: A novel approach towards ensuring food 
safety in shrimp aquaculture. Journal of Bangladesh Academy of Sciences, 33(1), 139-144. 
Schryver, P., Defoirdt, T. & Sorgeloos, P. (2014). Early Mortality Syndrome Outbreaks: A 
Microbial Management Issue in Shrimp Farming?. Pathogens magazines, Ghent University, 
Gent, Belgium. 
Ravi, A .V. et al. (2007). Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against 
pathogenic Vibrios in marine aquaculture. Lett Appl Microbiol, 45(2), 219-223. 
Reed, J. L. & Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent Endpoints. The 
American journal of hygiene, 27, 493-497. 
Tran, L. et al. (2013). Determination of the infectious nature of the agent of acute hepato-pancreatic 
necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 105, 45–55. 
Tổng cục Thủy sản (2014a). Hội thảo Khoa học bệnh Đốm trắng và bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên 
tôm nuôi nước lợ, 
benh/tinh-hinh-dich-benh-111om-trang-va-benh-hoai-tu-gan-tuy-cap-tren-tom-nuoi-nuoc-lo/. 
Tổng cục thủy sản (2014b). Tình hình sản xuất thủy sản năm 2014,  
thong-tin-huu-ich/thong-tin-thong-ke/thong-ke-1/tinh-hinh-san-xuat-thuy-san-nam-2014/. 
Trần Linh Thước (2010). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. 
NXB Giáo Dục Việt Nam, 70 trang. 
Vaseeharan, B., Lin, J. & Ramsamy, P. (2003). Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus 
subtilis BT23, a Possible Probiotic Treatment for Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon). 
Lett Appl Microbiol, 36(2), 83-87. 
Verschuere, L., Rombaut, P. & Verstraete, W. (2000). Probiotic bacteria as biological control 
agents in aquaculture. Microbiology Molecular Biology Reviews, 64(4), 655-671. 
Zorriehzahra, M.J. & Banaederakhshan, R. (2015). Early mortality syndrome (EMS) as new 
emerging threat in shrimp industry. Adv. Anim. Vet. Sci., 3, 64-72.