Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris

i hạn với cặp enzyme EcoRI 
và NotI. Kết quả cho thấy vector tái tổ hợp 
pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11 sau 
khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn cho hai 
băng sản phẩm, băng có kích thước nhỏ tương 
ứng với kích thước của gen VP28/EcoRI-NotI 
và băng có kích thước lớn tương đương kích 
thước của pPIC9K/EcoRI-NotI (Hình 4); ngoài 
ra không có vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng 
cắt đã được thực hiện hoàn toàn.
Hình 4. Kết quả cắt pPIC9K-VP28 với 
EcoRI và NotI
Giếng M1, M2: thang DNA 1kb và 100bp
Giếng 1, 2: Gen VP28/EcoRI-NotI; 
pPIC9K/EcoRI-NotI;
Giếng 3, 5, 4, 6: pPIC9K-VP28 của vi 
khuẩn 7 và 11 chưa và đã xử lý enzyme
84 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Để kiểm tra độ chính xác của trình tự 
gen VP28 và vị trí nối với vector pPIC9K, 
plasmid tái tổ hợp tách từ hai dòng 7 
và 11 được chọn giải trình tự tại công ty 
Nam Khoa (Việt Nam). Kết quả cho thấy 
giải trình tự gen VP28 của 2 dòng giống 
nhau và tương đồng 100% với các chủng 
WSSV được phân lập từ nhiều quốc gia 
gồm Hàn quốc (JX515788.1), Trung Quốc 
(AF332093.2), Nhật Bản (AY249443.1), Mỹ 
(AY249442.1), Indonesia (AY249441.1), Ấn 
Độ (DQ681069.1), Việt Nam (AY168644) 
đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu 
NCBI. Ngoài ra, phân tích dịch mã cho thấy 
gen VP28 đặt trong vector pPIC9K-VP28 
cho phép mã hóa một protein tái tổ hợp có 
204 a.a và được gắn thêm 6 Histidine vào 
đầu C-terminal của protein này (Hình 5).
 Hình 5. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid giả định protein VP28 được định mã từ 
vector pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11
Từ những kết quả trên, chúng tôi có thể 
khẳng định đã tạo được hai dòng vi khuẩn E.coli 
JM109 mang vector pPIC9k chứa gen mã hóa 
protein VP28 của virus WSSV. Trên vector 
pPIC9K, đoạn gen mã hóa protein VP28 được 
gắn thêm một trình tự nucleotide mã hóa 6xHis 
ở đầu 3’ đã được chèn vào vị trí ngay sau trình 
tự mã hóa peptide α-factor.
3.2. Kết quả chuyển plasmid pPIC9K-
VP28 vào nấm men P. pastoris GS115
Vector pPIC9K thuộc dạng vector sát nhập, 
khi biến nạp sẽ sát nhập vào bộ gen của tế bào 
chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng. Tế bào 
nấm men sau điện biến nạp được trải trên môi 
trường MD không có histidin và ủ trong 2-3 
ngày. Kết quả ghi nhận được có 400 khuẩn lạc 
mọc trên môi trường MD sau điện biến nạp.
3.3. Kết quả sàng lọc các dòng P. pastoris 
GS115 mang nhiều bản sao gen VP28 
Hai trăm khuẩn lạc mọc tốt, to, tròn, rời 
trên môi trường MD (trong đó có 100 khuẩn 
lạc clone 7 và 100 khuẩn lạc clone 11) được 
chọn để kiểm tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy 
lần lượt trên 3 môi trường MM, MD và YPD ở 
28°C trong 3 ngày. Kết quả nuôi cấy cho thấy 
182 khuẩn lạc có khả năng mọc tốt trên cả 3 
môi trường chọn lọc; các khuẩn lạc này sẽ được 
dùng cho quá trình chọn lọc tiếp theo.
Hình 6. Sự hiện diện của gene VP28 trong 
genome của 1 số chủng nấm men
Giếng M: Thang DNA 100bp
Giếng pPIC9K: plasmid pPIC9K.
Giếng p-VP28: plasmid pPIC9K-VP28
85TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Giếng P.P: Pichia pastoris
Giếng P.pPIC9K: P.pastoris –pPIC9K. 
Giếng 120, 120A, 125, 126, 179: chủng số 120, 
120A, 125, 126, 179
Sự hiện diện của gen VP28 trong 182 
khuẩn lạc nấm men chọn lọc được kiểm tra 
bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F 
và AOX1-R dựa trên khuôn mẫu là DNA tổng 
số của tế bào nấm men. Kết quả cho thấy các 
chủng nghiên cứu đều cho 2 vạch: khoảng 1.117 
bp (kích thước của gen VP28 thêm 492bp - kích 
thước từ vị trí bắt cặp của mồi trên hệ gen P. 
pastoris đến vị trí gắn chèn) và khoảng 2,2 
kb - kích thước của gen AOX1 (Hình 6). Như 
vậy, tất cả các chủng nấm men kiểm tra đều 
có chứa pPICK9K-VP28 trong genome; nói 
cách khác, gen VP28 đã được biến nạp thành 
công vào bộ gen của nấm men P. pastoris với 
kiểu hình Mut+.
Sau khi tạo dòng thành công, quá trình sàng 
lọc dòng P.pastoris có khả năng biểu hiện pro-
tein VP28 cao nhất được thực hiện bằng cách 
cấy chuyển 182 khuẩn lạc sang môi trường YDP 
có bổ sung G418 ở các nồng độ 4mg/l và 6mg/l. 
Kết quả sàng lọc đã xác định được 123/182 khuẩn 
lạc có khả năng kháng Geneticin 418 ở nồng độ 
4mg/l và 62 khuẩn lạc kháng G418 ở nồng độ 
6mg/l (Hình 7). Theo lý thuyết, 62 khuẩn lạc này 
có chứa 14-18 copy gene VP28 trong genome và 
chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu 
hiện protein VP28.
Hình 7. Kết quả chọn lọc dòng P. pastoris 
mang tái tổ hợp pPIC9K-VP28 kháng 6ppm 
Geneticin 
3.4. Kết quả sàng lọc các dòng P. 
pastoris GS115 có khả năng tiết protein 
VP28 ngoại bào
Sáu mươi hai chủng nấm men mang 
pPIC9K-VP28 đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm 
men mang pPICK9K (đối chứng âm) được cảm 
ứng biểu hiện protein trên môi trường nuôi 
cấy sinh khối BMGY và kích thích methanol 
2% trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự 
hiện diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy 
được phân tích bằng kỹ thuật Western blot với 
kháng thể đặc hiệu của VP28. Kết quả biểu hiện 
protein đã xác định được 25 chủng có sự hiện 
diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy. Tuy 
nhiên, chỉ 5 chủng: 120, 120A, 125, 126, 179 
cho vạch rõ ràng ở kích thước khoảng 28 kDa 
trên bản gel chạy Western blot với kháng thể 
kháng VP28 được dùng để nghiên cứu tiếp theo.
Hình 8. Protein VP28 trong dịch nuôi cấy 
nấm men
M: Thang protein; 
120, 120A, 125, 126, 179: các chủng nấm men
Ctrl(-): Chứng âm-nấm men có pPICK9K rỗng
3.5. Kết quả biểu hiện protein
Năm chủng nấm men có chứa pPICK9k-
VP28 trong genome có khả năng tiết protein 
ngoại bào được cảm ứng biểu hiện và lượng 
protein tiết ra trong dịch nuôi cấy được xác định 
theo thời gian: 24, 48 và 72 giờ. Kết quả đo hàm 
lượng protein theo thời gian trong quá trình nuôi 
cấy cho thấy cả 5 chủng nghiên cứu đều có khả 
năng tiết protein ngoại bào và lượng protein tiết 
ra tăng dần theo thời gian lên men từ 24 đến 72 
86 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
giờ (Đồ thị 1); Trong đó, chủng 126 có khả năng 
tiết ra lượng protein cao nhất (106,9μg/ml) sau 
72 giờ nuôi cấy.
Đồ thị 1. Nồng độ protein tổng số của các 
chủng nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau 
trong quá trình lên men
IV. THẢO LUẬN
Trên thế giới, nhiều tác giả đã dòng hóa và 
biểu hiện protein VP28 trong tế bào vi khuẩn 
khả biến E.coli để làm nguyên liệu để chế tạo 
vắc xin/tolerine (Witteveldt và ctv., 2004; 2006; 
Satoh và ctv., 2008). Ngoài E. coli, một số nhà 
nghiên cứu còn sử dụng các vi khuẩn khả biến 
khác như: vi khuẩn gram dương Brevibacillus 
brevis (Caipang et al., 2008), hoặc tế bào côn 
trùng (Du et al., 2006) để dòng hóa các gen vỏ 
của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. 
Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi 
Thị Bích Hằng (2012) cũng đã thành công trong 
việc dòng hóa gen VP28 của virus đốm trắng 
vào tế bào khả biến E.coli để tạo kháng thể ứng 
dụng trong việc chẩn đoán nhanh bệnh. Việc 
dùng tế bào nấm men để dòng hóa và biểu hiện 
protein chỉ được 1 nhóm nhỏ các nhà nghiên 
cứu quan tâm nhưng hiệu quả bảo vệ của loại 
vắc xin/tolerine - sản phẩm của quá trình dòng 
hóa này - mang lại cao hơn và cho thời gian 
bảo hộ dài hơn các loại vắc xin/tolerine khác. 
Cụ thể, Jha và ctv (2006, 2007) đã xác định 
dùng rVP28 biểu hiệu qua tế bào nấm men bằng 
phương pháp tiêm hoặc cho ăn đều đem lại hiệu 
quả bảo vệ cho crayfish trước bệnh đốm trắng 
sau 3 ngày và kéo dài tới 21 ngày sau khi dùng 
rVP28. Trong khi đó, thời gian bảo hộ của rVP28 
biểu hiện bằng vi khuẩn gram âm E.coli hoặc vi 
khuẩn gram dương Brevibacillus choshinensis 
và B. brevis trên tôm lần lượt là 10 ngày, 7 ngày 
và 14 ngày (Caipang et al., 2008; Mavichak 
et al., 2009; Witteveldt et al., 2006). Chính vì 
vậy, việc tạo ra nguyên liệu là dòng nấm men có 
mang pPICK9K-VP28 có khả năng tiết protein 
ngoại bào là bước khởi đầu cho những nghiên 
cứu về vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng 
cho tôm nuôi ở Việt Nam.
V. KẾT LUẬN 
Đoạn gen VP28 của virus gây bệnh đốm 
trắng trên tôm đã được nhân bản, gắn với 
plasmid pPICK9K và dòng hóa thành công vào 
vi khuẩn khả nạp E. coli JM109 và tế bào nấm 
men P. pastoris GS 115. 
Năm chủng nấm men Pichia patoris có chứa 
pPICK9K-VP28 trong bộ gen có khả năng biểu 
hiện được protein mục tiêu VP28 dạng ngoại 
bào trong điều kiện cảm ứng bằng methanol với 
nồng độ 2% và lượng protein tổng số tiết ra cao 
nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Quỳnh Anh, 2006. Báo cáo đề tài: “Dòng hoá và 
biểu hiện Gen mã hoá Protein vỏ VP28 và VP281 
của Virus gây hội chứng đốm trắng ( WSSV ) trong 
E.coli”.
Bùi Thị Bích Hằng, 2012. Tạo tái tổ hợp DNA VP28 
của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm 
sú. Tạp chí khoa học 2012:22a 1-7. Trường Đại 
Học Cần Thơ.
Cục Thúy Y- Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 
2012. Báo cáo Hội nghị tổng kết nuôi tôm nước 
lợ. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi năm 2012 
và triển khai kế hoạch năm 2013.
Cục Thú Y - Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 
2013. Báo cáo Tình hình dịch bệnh, dịch tễ 
87TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
bệnh đốm trắng (WSD) và hoại tử gan tụy cấp 
(AHPND) ở tôm nuôi 7 tháng đầu năm 2013 và 
một số đề xuất quản lý rủi ro đối với AHPND. Tài 
liệu phục vụ Hội nghị tại Bạc Liêu – 6/8/2013.
Tài liệu tiếng Anh
Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, 
H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., 
2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus 
(Marsupenaeus) japonicus from white spot 
syndrome disease after oral administration of 
recombinant VP28 expressed in Brevibacillus 
brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.
Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C. 
and Lo, C.F, 1995. Pathogenicity of a baculovirus 
infection causing white spot syndrome in 
cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of 
Aquatic Organisms. 23(3):p. 165-173.Du, H.H., 
Xu, Z. R., Wu, X. F., Li, W. F., Dai, W., 2006. 
Increased resistance to white spot syndrome virus 
in Procambarus clarkii by injection of envelope 
protein VP28 expressed using recombinant 
baculovirus. Aquaculture, 2006 260(1-4), p. 39-43.
Huang, J., Song, X.L., Yu, J., Yang, C.H., 1994. 
Baculoviral hypodermal and haematopoietic 
necrosis-pathology of the shrimp explosive 
epidermic disease. Yellow Sea Fishery Research 
Institute, Qingdae, P.R. China.Jha, R.K., Xu, Z. 
R., Bai, S. J., Sun, J. Y., Li, W. F., Shen, J., 2007. 
Protection of Procambarus clarkii against white 
spot syndrome virus using recombinant oral vac-
cine expressed in Pichia pastoris. Fish & Shellfish 
Immunology, 2007. 22(4), p. 295-307.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006. The efficacy 
of recombinant vaccines against white spot syn-
drome virus in Procambarus clarkii. Immunology 
Letters, 2006. 105(1), p. 68-76.
Mavichak, R. K., Hirino, H., Aoki, I., Kiyono, T., 
Yuki, Y., 2009. Protection of pacific white shrimp, 
Liptopenaeus vannamei against white spot virus 
following administration of N-terminus truncated 
recombinant VP28 protein expressed in Gram 
positive bacteria, Brevibacillus choshinensis. 
Aquaculture Science 57:83-90. Satoh, J., T. 
Nishizawa, Yoshimizu, M., 2008. “Protection 
against white spot syndrome virus (WSSV) 
infection in kuruma shrimp orally vaccinated with 
WSSV rVP26 and rVP28.” Diseases of Aquatic 
Organisms 82(2), 89-96.
Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., 
Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S., 
1994. Electron microscopy evidence of bacilliform 
virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus 
Japonicus). Fish Pathol 29:121-125.Venegas, 
C. A., L. Nonaka, Mushiake, K., Nishizawa, T., 
Muroga, K., 2000. “Quasi-immune response of 
Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA 
virus (PRDV).” Diseases of Aquatic Organisms 
42(2), 83-89.
Van Hulten M.C., Westenberg M., Goodall S.D., Vlak 
J.M., 2000. Identification of two major virion 
protein genes of white spot syndrome virus of 
shrimp. Virology 266, 227-36.
Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., 
Tung, M., Chang, C., Su, M. and Kou, G., 1995. 
Purification and genomic analysis of baculovirus 
associated with white spot syndrome (WSBV) 
of Penaeus monodon. Diseases of Aquatic 
Organisms, 1995. 23, 239-242.
Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2004. 
“Protection of Penaeus monodon against white 
spot syndrome virus using a WSSV subunit vác 
xin.” Fish & Shellfish Immunology 16(5), 571-579
Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2006. 
“Increased tolerance of Litopenaeus vannamei 
to white spot syndrome virus (WSSV) infection 
after oral application of the viral envelope protein 
VP28.” Diseases of Aquatic Organisms 70(1-2), 
167-170.
Wongteerasupaya C., Vicker J.E., Sriurairatana S., 
Nash G.L., Akarajarmorn A., Boonsaeng V., 
Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul 
B., Flegel T.W., 1995. A nonoccluded, systemic 
baculovirus that occurs in cells of ectodermal and 
mesodermal origin and causes high mortality in 
the black tiger prawn Penaeus monodon. Disease 
of Aquatic Organism 21, 69–77
88 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
DEVELOP DNA RECOMBINANT VP28 OF WHITE SPOT SYNDROME 
VIRUS IN YEAST PICHIA PASTORIS
Ngo Thi Ngoc Thuy1, Nguyen Viet Dung2, Dang Thi Tra My1 
ABSTRACT
White spot syndrome virus (WWSSV) is a popular and devastating virus to Penaeus shrimp-culture industry 
worldwide. The aim of this study is to develope DNA recombinant VP28 of the virus in yeast P. pastoris for 
expressing protein VP28 extracellularly in order to make materials for recombinant protein vaccine/tolerine 
against WSSV in shrimp. DNA fragment content of VP28 was amplified from WSSV and its product was di-
gested by restriction enzyme EcoRI and NotI; then cloned into plasmid pPICK9K to make recombinant vector 
pPICK9K-VP28. This vector, after that was transformed into Pichia pastoris GS115 to express protein VP28. 
The screening of 200 yeast clones after transformation was conducted and 5 yeast clones which expressed 
protein VP28 extracellular were selected for Bradford assay. The results indicated that the total extracellular 
protein containing VP28 increased with fermentation periods of 24, 48 and 72 hours and the highest concen-
tration of total protein reached to 106.9 μg.ml-1. 
Keywords: Pichia pastoris, protein, VP28 , WSSV
Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền 
Ngày nhận bài: 10/02/2014
Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014
Ngày duyệt đăng: 30/3/2014
1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research, Research Institute for Aquaculture No 2. 
 Email: thuyngo8@yahoo.com 
2 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 2.