Bệnh vi khuẩn mới nổi nguy hiểm ở cá hồi vân và nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh

.
Kết	quả	thử	nghiệm	sinh	hóa	cho	thấy	36	
chủng	vi	khuẩn	này	là	đồng	nhất	về	mặt	sinh	
hóa	và	chúng	có	sự	tương	đồng	cao	với	cả	hai	
chủng	W. ceti	đối	chứng	(NC36	và	CECT7719)	
về	19	trong	số	20	chỉ	tiêu	sinh	hóa	được	kiểm	
tra	bằng	bộ	 test	API	20	STREP.	36	chủng	vi	
khuẩn	 phân	 lập	 được	 và	 chủng	 CECT7719	
là	 âm	 tính	với	 chỉ	 tiêu	 arginine	dihydrolase,	
ngược	lại	chủng	NC36	dương	tính	với	chỉ	tiêu	
này.	 Trong	 khi	 đó	 chủng	 CECT7719	 dương	
tính	với	chỉ	tiêu	thủy	phân	esculin,	trong	khi	
54
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
36	chủng	vi	khuẩn	phân	lập	được	và	chủng	NC36	là	âm	tính	với	chỉ	tiêu	thủy	phân	esculin	(bảng	2).
a b
Hình 2. Hình thái của vi khuẩn W. ceti
Bảng 2. Kết quả thử sinh hóa các chủng Weissella ceti phân lập từ cá hồi vân bị bệnh (n = 36)
Chỉ tiêu 36 chủng trong nghiên cứu này*
Chủng đối chứng
NC36** CECT7719***
Pyruvate (Acetoin production) + + +
Hippurate (Hydrolysis) + + +
Esculin (β-glucosidase) - - +
pyrrolidonyl-2-naphthylamide (Pyrrolidonylarylamidase) - - -
6-Br-2-naphthvl-α-D- galactopyranoside　 
(α-galactosidase) - - -
naphthol AS-BI β-D- glucuronat 
(β-glucuronidase) - - -
2-naphthyl-β-D- galactopyranoside 
(β-galactosidase) - - -
2-naphthylphosphate (Alkaline phosphatase) + + +
L-leucyl-2-naphthylamide (Leucinearylamidase) + + +
Arginine (Arginine dehydrolase ) - + -
Ribose (acidification) + + +
L-arabinose (acidification) - - -
Mannitol (acidification) - - -
Sorbitol (acidification) - - -
Lactose (acidification) - - -
Trehalose (acidification) + + +
Inulin (acidification) - - -
Raffinose (acidification) - - -
Starch (acidification) - - -
Glycogen (acidification) - - -
(*) Bảng 1; (**) Chủng vi khuẩn phân lập từ cá hồi vân ở Mỹ, các chỉ tiêu hóa sinh đã được báo cáo 
(Welch và Good, 2013); (***) Chủng vi khuẩn phân lập từ cá voi mỏ khoằm ở Tây Ban Nha
55
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
Kết	quả	phân	tích	trình	tự	gen	16S	rRNA	của	
36	chủng	cho	thấy	chúng	có	trình	tự	đoạn	gen	16S	
rRNA	có	độ	tương	đồng	rất	cao	(100%)	với	độ	dài	
là	1.481	bp.	Phân	tích	BLAST	đoạn	gen	16S	rRNA	
cho	thấy	trình	tự	này	tương	đồng	cao	(tỷ	lệ	tương	
đồng	96%	đến	99%)	với	các	thành	viên	của	loài	
Weissella.	Kết	quả	phân	tích	đoạn	gen	16R	rRNA	
và	cây	phả	hệ	cho	thấy	các	chủng	vi	khuẩn	phân	
lập	được	có	sự	tương	đồng	cao	nhất	với	Weissella	
sp.	gây	bệnh	ở	Trung	Quốc,	Brazil	và	Mỹ	((Liu,	Li	
et al.,	2009;	Figueiredo,	Costa	et al.,	2012;	Welch	
và	Good,	2013)	(hình	3).
Hình 3. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự gen 16S rRNA của các chủng 
Weissella sp. chủng Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811 là đối chứng nhóm ngoài
Kết	quả	của	xét	nghiệm	PCR	cho	thấy	tất	cả	các	
chủng	phân	lập	từ	cá	hồi	vân	gây	bệnh	Weissellosis	
trong	nghiên	cứu	này	đều	có	cả	hai	sản	phẩm	khuếch	
đại	của	đoạn	gen	16S	rRNA	đặc	trưng	725	bp	và	sản	
phẩm	khuếch	đại	500	bp	là	các	đoạn	gen	đặc	trưng	và	
liên	quan	đến	các	yếu	tố	độc	lực	bao	gồm	collagen-
like	và	platelet-associated	adhesive	proteins	(hình	4).	
Vị	trí	gen	đặc	trưng	có	chiều	dài	500	bp	có	trong	bộ	
gen	của	chủng	vi	khuẩn	W. ceti	NC36	được	phân	lập	
từ	cá	hồi	vân	ở	Hoa	Kỳ	(Welch	et al.,	2013)	nhưng	
không	được	phát	hiện	trong	bộ	gen	của	các	loài	vi	
khuẩn	Weissella	khác	và	bộ	gen	của	chủng	W. ceti	
CECT7719	phân	lập	từ	cá	voi	mõm	khoằm	nên	đã	
được	sử	dụng	để	xác	nhận	sự	hiện	diện	của	W. ceti	
trong	sự	bùng	phát	bệnh	Weissellosis	trên	cá	hồi	vân	
(Snyder	et al.,	2015).	Những	kết	quả	này	chỉ	ra	rằng	
vi	khuẩn	gây	bệnh	Weissellosis	trên	cá	hồi	vân	trong	
nghiên	cứu	này	là	W. ceti.	Điều	này	cũng	củng	cố	
tính	đặc	hiệu	của	đoạn	mồi	sử	dụng	trong	chẩn	đoán	
W. ceti	gây	bệnh	Weissellosis	trên	cá	hồi	vân	bằng	
phương	pháp	PCR	kép	đã	được	công	bố	ở	báo	cáo	
trước	đây	(Snyder	et al.,	2015).
 W. ceti NC36 (WCNC r01255)
 Weiaaella sp. JZ-1L (EU869290)
 Weissella sp. (KC461925)
 W. ceti (KY697255)
 Weissella sp. WS-08 (GU112514)
 W. ceti 1119-1A-09 (FN813251)
 W. halotolerans (AB022926)
 W. viridescens (AB023236)
 W. minor (AB022920)
 W. thailandensis (AB023838)
 W. paramesenteroides (AB023238)
 W. hellenica (S67831)
 W. cibaria (AJ295989)
 W. confusa (AB023241)
 W. kandleri (AB022922)
 W. koreensis (AY035891)
 W. soli (AY028260)
 W. beninensis (EU439435)
 W. ghanensis (AM882997)
 W. fabaria (FM179678)
 Leuconostoc gasicomitatum (AF231131)
100
100
86
100
100
31
55
90
93
100
94
83
53
63
20
32
69
28
0.01
56
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
Hình 4. Kết quả kiểm tra PCR kép để xác định sự hiện diện của W. ceti
Giếng M: DNA tiêu chuẩn; Giếng 1-36: Lần lượt các chủng vi khuẩn W. ceti trong nghiên cứu này 
(bảng 1). Giếng 37: W. ceti CECT7719 được phân lập từ cá voi mỏ khoằm
3.2. Phân lập và định danh thực khuẩn thể 
Pwr-1
Đốm	thực	khuẩn	thể	Pwr-1	(vòng	vô	khuẩn	
do	Pwr-1	tạo	ra)	có	hình	tròn,	rõ	ràng,	trong	suốt	
và	không	có	sự	hiện	diện	của	vi	khuẩn	W. ceti	
với	đường	kính	từ	0,7	-	2	mm	(hình	5A).	Hình	
ảnh	 chụp	 bằng	 kính	 hiển	 vi	 điện	 tử	 cho	 thấy	
Pwr-1	có	đường	kính	đầu	khoảng	60	-	65	nm	và	
đuôi	hình	trụ	và	linh	hoạt	với	chiều	dài	khoảng	
170	-	180	nm,	chiều	rộng	9	-	10	nm	(hình	5B).	
Theo	các	đặc	điểm	hình	thái	và	dựa	trên	sự	phân	
loại	của	Ackermann	(Ackermann,	2001),	Pwr-1	
thuộc	về	họ	Siphoviridae.
Hình 5. Đốm thực khuẩn thể và hình thái học của thực khuẩn thể Pwr-1. thước: 100nm
a b
3.3. Thời gian lây nhiễm và khả năng diệt 
khuẩn của Pwr-1
Kết	quả	trong	hình	6	cho	thấy	thời	gian	tiềm	
tàng	của	Pwr-1	được	xác	định	là	khoảng	25	phút	
và	số	lượng	thực	khuẩn	thể	được	giải	phóng	là	
16	thực	khuẩn	thể/tế	bào	bị	nhiễm.	Kết	quả	của	
thử	 nghiệm	kiểm	 tra	 phổ	 diệt	 khuẩn	 cho	 thấy	
rằng	Pwr-1	có	phổ	diệt	khuẩn	rộng	và	có	thể	lây	
nhiễm	trên	tất	cả	các	chủng	W. ceti	được	phân	
lập	(n	=	36)	từ	cá	hồi	vân	bị	nhiễm	bệnh	trong	
nghiên	cứu	này.	Pwr-1	không	thể	diệt	chủng	vi	
khuẩn	W. ceti	 CECT7719	 (phân	 lập	 từ	 cá	 voi	
mõm	khoằm),	 chủng W. cibaria	 (VN16-10	 và	
VN16-11	phân	lập	từ	cá	trắm	cỏ)	và	Lactococcus 
lactis subsp. lactis ATCC19435	(bảng	3).
A B
57
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
Bảng 3. Các chủng vi khuẩn được sử dụng để xác định phổ diệt khuẩn của Pwr-1
Loài vi khuẩn Tên chủng Nguồn phân lập Năm phân lập Kết quả kiểm tra
W. ceti WM1 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM2 Cá hồi vân 2012 ++++
W. ceti WM3 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM4 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM5 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM6 Cá hồi vân 2012 ++++
W. ceti WM7 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM8 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM9 Cá hồi vân 2012 ++++
W. ceti WM10 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM11 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM12 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM13 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM14 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM15 Cá hồi vân 2012 ++++
W. ceti WM16 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM17 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM18 Cá hồi vân 2012 ++
W. ceti WM19 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM20 Cá hồi vân 2012 +++
W. ceti WM21 Cá hồi vân 2014 ++++
W. ceti WM22 Cá hồi vân 2014 +++
W. ceti WM23 Cá hồi vân 2014 ++
W. ceti WM24 Cá hồi vân 2014 +++
W. ceti WM25 Cá hồi vân 2014 ++
W. ceti WM26 Cá hồi vân 2014 ++++
W. ceti WM27 Cá hồi vân 2014 ++++
W. ceti WM28 Cá hồi vân 2014 ++
W. ceti WM29 Cá hồi vân 2015 +++
W. ceti WM30 Cá hồi vân 2015 ++
W. ceti WM31 Cá hồi vân 2015 ++++
W. ceti WM32 Cá hồi vân 2016 +++
W. ceti WM33 Cá hồi vân 2016 ++
W. ceti WM34 Cá hồi vân 2016 +++
W. ceti WM35 Cá hồi vân 2016 +++
W. ceti WM36 Cá hồi vân 2016 ++++
W. ceti CECT7719 Cá voi mõm khoằm 2010 -
W. cibaria VN16-10 Cá trắm cỏ 2016 -
W. cibaria VN16-11 Cá trắm cỏ 2016 -
L.lactis sub.lactis ATCC19435 - - -
58
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
3.4. Khả năng tồn tại của Pwr-1 trong điều 
kiện bất lợi
Kết	 quả	 thử	 nghiệm	 khả	 năng	 tồn	 tại	 của	
Pwr-1	ở	các	giá	trị	pH	khác	nhau	cho	thấy	Pwr-1	
có	khả	năng	chịu	đựng	tốt	với	khoảng	pH	rộng.	
Cụ	thể,	Pwr-1	phát	triển	tốt	nhất	ở	khoảng	pH	
7,0	và	tồn	tại	ở	một	loạt	các	giá	trị	pH	khác	với	
hơn	60%	Pwr-1	có	 thể	hoạt	động	ở	pH	4	-	10	
và	hơn	40%	ở	pH	3,0.	Đặc	biệt,	một	vài	 thực	
khuẩn	 thể	Pwr-1	 vẫn	 có	 thể	 tồn	 tại	 ở	 pH	2,0.	
Tuy	nhiên,	các	thực	khuẩn	thể	hoàn	toàn	bị	mất	
khả	năng	lây	nhiễm	ở	pH	1,0	(hình	7).	Kết	quả	
kiểm	tra	khả	năng	chịu	nhiệt	(hình	8)	cho	thấy	
Pwr-1	chịu	đựng	khá	tốt	với	khoảng	nhiệt	độ	từ	
40	đến	60°C,	với	hơn	90%	sống	ở	khoảng	nhiệt	
độ	40	 -	50°C	và	63,3%	sống	ở	nhiệt	độ	60°C	
sau	1	giờ.	Mật	độ	 thực	khuẩn	 thể	giảm	nhanh	
chóng	ở	nhiệt	độ	70°C	(giảm	90%	sau	15	phút)	
và	 không	 phát	 hiện	 thấy	Pwr-1	 tồn	 tại	 sau	 30	
phút	ở	nhiệt	độ	này.	Ở	nhiệt	độ	80°C	và	90°C,	
không	phát	hiện	thấy	Pwr-1	còn	tồn	tại	sau	15	
phút.	Việc	Pwr-1	có	phổ	diệt	khuẩn	khá	 rộng,	
khả	năng	hoạt	động	 trong	khoảng	pH	 rộng	và	
tồn	tại	ở	khoảng	nhiệt	độ	lên	tới	60°C	mở	ra	khả	
năng	 sử	dụng	Pwr-1	 trong	điều	 trị	 bệnh	do	vi	
khuẩn	W. ceti trên	cá	hồi	vân.
Hình 6. Khả năng tăng trưởng của Pwr-1. Thời gian tiềm tàng và số lượng thực khuẩn 
thể Pwr-1 được giải phóng. L: pha tiềm tàng; R: pha sinh trưởng và P: pha đỉnh
Hình 7. Khả năng chống chịu của Pwr-1 ở môi trường có độ pH khác nhau
59
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Trong	nghiên	cứu	đã	phân	lập	được	36	chủng	
vi	khuẩn	W. ceti	trên	cá	hồi	vân	bị	nhiễm	bệnh	
Weissellosis	có	triệu	chứng	bệnh	được	mô	tả	và	
tác	nhân	vi	khuẩn	gây	bệnh	có	sự	 tương	đồng	
cao	về	mặt	di	truyền	với	các	chủng	W. ceti	gây	
bệnh	 trên	 cá	 hồi	 vân	 đã	 phân	 lập	 được	 ở	 các	
nước	khác	nhau	trên	thế	giới.	
	Lần	đầu	tiên,	thực	khuẩn	thể	(Pwr-1)	được	
phân	lập	thành	công	có	khả	năng	tiêu	diệt	mầm	
bệnh	W. ceti.	Pwr-1	có	thời	gian	tiềm	tàng	ngắn,	
số	lượng	thực	khuẩn	thể	được	giải	phóng	tương	
đối	 cao,	 khả	 năng	 chịu	 đựng	 với	 khoảng	 pH	
rộng,	nhiệt	độ	cao,	có	phổ	diệt	khuẩn	rộng	và	
khả	năng	diệt	khuẩn	rất	mạnh.	Những	kết	quả	
này	cho	thấy	Pwr-1	có	nhiều	tính	năng	thuận	lợi	
và	có	triển	vọng	cao	để	sử	dụng	trong	điều	trị	
bệnh	Weissellosis	trên	cá	hồi	vân.
4.2. Đề nghị
Nghiên	 cứu	 thử	 nghiệm	 phương	 pháp	 sử	
dụng	 thực	 khuẩn	 thể	 cho	 kết	 quả	 điều	 trị	 cao	
nhất	ở	quy	mô	phòng	thí	nghiệm	và	áp	dụng	ở	
thực	tế	tại	các	trại	nuôi	cá	hồi	vân.	
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.	 Ackermann,	 H.-W.	 (2001).	 “Frequency	 of	
morphological	phage	descriptions	in	the	year	
2000.”	Archives of virology	146(5):	843-857.
2.	 Adams,	 M.	 H.	 (1959).	 “Bacteriophages.”	
Interscience,	New	York.
3.	 Figueiredo,	 H.,	 F.	 Costa,	 C.	 Leal,	 G.	
Carvalho-Castro	 and	 R.	 Leite	 (2012).	
“Weissella	 sp.	 outbreaks	 in	 commercial	
rainbow	trout	(Oncorhynchus mykiss)	farms	
in	 Brazil.”	Veterinary Microbiology	 156(3-
4):	359-366.
4.	 Figueiredo,	H.	C.,	S.	C.	Soares,	F.	L.	Pereira,	
F.	A.	Dorella,	A.	F.	Carvalho,	J.	P.	Teixeira,	
V.	 A.	 Azevedo	 and	 C.	 A.	 Leal	 (2015).	
“Comparative	genome	analysis	of	Weissella 
ceti,	 an	 emerging	 pathogen	 of	 farm-raised	
rainbow	trout.”	BMC genomics	16(1):	1095.
5.	 Kot,	 W.,	 H.	 Neve,	 K.	 J.	 Heller	 and	 F.	 K.	
Vogensen	 (2014).	 “Bacteriophages	 of	
leuconostoc,	 oenococcus,	 and	 weissella.”	
Frontiers in microbiology	5:	186.
6.	 Ladner,	J.	T.,	T.	J.	Welch,	C.	A.	Whitehouse	
and	G.	F.	Palacios	(2013).	“Genome	sequence	
of	 Weissella ceti	 NC36,	 an	 emerging	
pathogen	 of	 farmed	 rainbow	 trout	 in	 the	
United	 States.”	 Genome announcements 
1(1):	e00187-00112.
7.	 Lane,	 D.	 (1991).	 “16S/23S	 rRNA	
Hình 8. Khả năng chịu nhiệt của Pwr-1
60
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019
sequencing.”	 Nucleic	 acid	 techniques	 in	
bacterial	systematics:	115-175.
8.	 Liu,	 J.	Y.,	A.	H.	Li,	C.	 Ji	 and	W.	M.	Yang	
(2009).	 “First	 description	 of	 a	 novel	
Weissella	 species	 as	 an	 opportunistic	
pathogen	 for	 rainbow	 trout	 Oncorhynchus 
mykiss	 (Walbaum)	 in	 China.”	 Veterinary 
microbiology	136(3-4):	314-320.
9.	 Lu,	 Z.,	 I.	 M.	 Perez-Diaz,	 J.	 S.	 Hayes	 and	
F.	 Breidt	 (2012).	 “Bacteriophage	 ecology	
in	 a	 commercial	 cucumber	 fermentation.”	
Applied and environmental microbiology: 
AEM.	01914-01912.
10.	Marancik,	 D.	 P.,	 T.	 J.	Welch,	 T.	 D.	 Leeds	
and	G.	D.	Wiens	 (2013).	 “Acute	mortality,	
bacterial	load,	and	pathology	of	select	lines	
of	 adult	 rainbow	 trout	 challenged	 with	
Weissella	 sp.	 NC36.”	 Journal of aquatic 
animal health	25(4):	230-236.
11.	Mitomi,	 K.,	 T.	 Hoai,	 I.	 Nishiki	 and	 T.	
Yoshida	(2018).	“First	isolation	of	Weissella 
ceti	responsible	for	outbreaks	of	weissellosis	
in	 farmed	 rainbow	 trout	 in	 Japan.”	Journal 
of fish diseases	41(5):	847-850.
12.	Oliveira,	 J.,	 F.	 Castilho,	A.	 Cunha	 and	M.	
Pereira	 (2012).	 “Bacteriophage	 therapy	 as	
a	bacterial	control	strategy	 in	aquaculture.”	
Aquaculture International	20(5):	879-910.
13.	Pringsulaka,	 O.,	 N.	 Patarasinpaiboon,	 N.	
Suwannasai,	W.	Atthakor	and	A.	Rangsiruji	
(2011).	 “Isolation	 and	 characterisation	 of	 a	
novel	Podoviridae-phage	infecting	Weissella 
cibaria	N	22	from	Nham,	a	Thai	fermented	
pork	 sausage.”	 Food microbiology	 28(3):	
518-525.
14.	Saitou,	 N.	 and	 M.	 Nei	 (1987).	 “The	
neighbor-joining	method:	 a	 new	method	 for	
reconstructing	phylogenetic	trees.”	Molecular 
biology and evolution	4(4):	406-425.
15.	Schleifer,	K.,	J.	Kraus,	C.	Dvorak,	R.	Kilpper-
Bälz,	 M.	 Collins	 and	 W.	 Fischer	 (1985).	
“Transfer	of	Streptococcus lactis	and	related	
streptococci	 to	 the	 genus	Lactococcus	 gen.	
nov.”	Systematic and Applied Microbiology 
6(2):	183-195.
16.	Snyder,	A.,	J.	Hinshaw	and	T.	Welch	(2015).	
“Diagnostic	 tools	 for	 rapid	 detection	 and	
quantification	 of	 Weissella ceti	 NC	 36	
infections	 in	 rainbow	 trout.”	 Letters in 
applied microbiology	60(2):	103-110.
17.	Tamura,	 K.,	 G.	 Stecher,	 D.	 Peterson,	 A.	
Filipski	 and	 S.	 Kumar	 (2013).	 “MEGA6:	
molecular	 evolutionary	 genetics	 analysis	
version	 6.0.”	 Molecular biology and 
evolution	30(12):	2725-2729.
18.	Thompson,	 J.	 D.,	 D.	 G.	 Higgins	 and	 T.	 J.	
Gibson	 (1994).	 “CLUSTAL	W:	 improving	
the	 sensitivity	 of	 progressive	 multiple	
sequence	 alignment	 through	 sequence	
weighting,	 position-specific	 gap	 penalties	
and	 weight	 matrix	 choice.”	 Nucleic acids 
research	22(22):	4673-4680.
19.	Vela,	A.	I.,	A.	Fernández,	Y.	B.	de	Quirós,	P.	
Herráez,	L.	Domínguez	and	J.	F.	Fernández-
Garayzábal	(2011).	“Weissella	ceti	sp.	nov.,	
isolated	 from	 beaked	 whales	 (Mesoplodon	
bidens).”	International journal of systematic 
and evolutionary microbiology	 61(11):	
2758-2762.
20.	Welch,	 T.	 J.	 and	 C.	 M.	 Good	 (2013).	
“Mortality	 associated	 with	 Weissellosis	
(Weissella	 sp.)	 in	 USA	 farmed	 rainbow	
trout:	potential	 for	control	by	vaccination.”	
Aquaculture	388:	122-127.
21.	Woo,	P.	T.	and	R.	C.	Cipriano	(2017).	Fish	
Viruses	 and	 Bacteria:	 Pathobiology	 and	
Protection, CABI.
Ngày	nhận	19-8-2018
Ngày	phản	biện	26-11-2018
Ngày	đăng	1-3-2019