Thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmHyPRP1, một gen của cây đậu tương liên quan tới quá trình chống chịu đa stress phi sinh học

y GmHyPRP1 có chứa vùng 
8CM và 4 liên kết disulfide ở đầu C- nhằm đảm bảo 
sự liên kết giữa các phần ở đầu N- và C và thuộc phân 
họ protein AAI_LTSS (Alpha-Amylase Inhibitors_ 
Lipid Transfer and Seed Storage) của nhóm protein 
lai HyPRP (Hình 2). 
Qua kết quả tìm kiếm và phân tích trình tự cho 
thấy, gen GmHyPRP1 có kích thước 684 bp và mã 
hóa cho 228 amino axit thuộc họ protein giàu proline 
lai HyPRP. Đã lựa chọn GmHyPRP1 làm đối tượng để 
chỉnh sửa và tiến hành thiết kế các sgRNA nhằm xây 
dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 mang các 
sgRNA để chỉnh sửa gen GmHyPRP1 trên cây đậu 
tương. 
3.2. Kết quả thiết kế các sgRNA của gen 
GmHyPRP1 
Khi sử dụng công cụ CRISPR-P2 cho thiết kế 
sgRNA của gen GmHyPRP1, đã thu được kết quả 
như hình 3. 
Hình 3. Vị trí các đoạn sgRNA trên trình tự gen 
GmHyPRP1 
Kết quả cho thấy có 116 sgRNA nằm rải rác trên 
toàn bộ chiều dài của gen GmHyPRP1. Dựa trên kết 
quả tìm kiếm sgRNA cho gen chỉnh sửa gen 
GmHyPRP1, đã lựa chọn được 4 sgRNA lần lượt được 
ký hiệu là sgRNA1-4 (Bảng 2). 
Bảng 2. Các sgRNA được lựa chọn cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 
TT Tên Trình tự đích sgRNA Vị trí Số lượng 
ngoài 
mục tiêu 
đích (<4 
MMs) 
1 GmHyPRP1_sgRNA1 CCCAAAAAGCACAAGCCTGG CCAGGCTTGTGCTTTTTGGG 94 1 
2 GmHyPRP1_sgRNA2 GCACAGGCTACATGCCCC GGGGCATGTAGCCTGTGC 415 9 
3 GmHyPRP1_sgRNA3 CATTGACACGCTCAAACTAG CCTAGTTTGAGCGTGTCAAT 433 3 
4 GmHyPRP1_sgRNA4 AGTTAAGTCCCCCCAAACTC TAGAGGGAGCAGGTGTAACC 661 0 
Bảng 2 cho thấy, 4 sgRNA(1-4) nằm lần lượt ở vị 
trí nucleotid 94, 415, 433 và 461 ở cả đầu N- và đầu C- 
của gen GmHyPRP1, đồng thời một số sgRNA này có 
thể chỉnh sửa một số vị trí ngoài mục tiêu đích với sự 
bắt cặp lỗi không phù hợp (mismatch, MM) ít hơn 4. 
Như vậy, đã lựa chọn 4 đoạn sgRNA này để sử dụng 
cho việc thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9 cho chỉnh 
sửa gen GmHyPRP1. 
3.3. Xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 
chứa các sgRNA của gen GmHyPRP1 
Để tiến hành thiết kế vector binary có chứa hệ 
thống CRISPR/Cas9 cùng với các sgRNA(1-4) cho 
chỉnh sửa gen GmHyPRP1, đầu tiên, các sgRNA và 
promoter U6 được khuếch đại bằng PCR với các cặp 
mồi như trình bày ở bảng 1. Cụ thể, cặp mồi U6-
F/U6-R được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA của 
promoter U6 và các cặp mồi GmHyPRP1_sgRNA(1-
4)-F/GmHyPRP1_sgRNA-R để khuếch đại các đoạn 
DNA của các GmHyPRP1_sgRNA(1-4) tương ứng. 
Hơn nữa, ở đầu 5’ của các mồi đều được bổ sung vị trí 
của enzyme giới hạn BsaI GGTCTCA(N4). 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 14 
Hình 4. Kết quả khuếch đại promoter U6 và các 
sgRNA(1-4) bằng PCR và kiểm tra các sản phẩm tái 
tổ hợp của các U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) 
Chú thích: (A) Sản phẩm khuếch đại của 
promoter U6 và các sgRNA(1-4); (B) Sản phẩm tái tổ 
hợp của các U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) được cắt 
kiểm tra bằng enzyme giới hạn BpiI. M, thang chuẩn 
DNA 100 bp plus; 1, sản phẩm PCR của promoter U6; 
2-5, sản phẩm PCR của các đoạn DNA chứa các 
sgRNA(1-4); 6-9, các khuẩn lạc của 
U6:GmHyPRP1_sgRNA1; 10-13, các khuẩn lạc của 
U6:GmHyPRP1_sgRNA2; 14-17, các khuẩn lạc của 
U6:GmHyPRP1_sgRNA3; 18-21, các khuẩn lạc của 
U6:GmHyPRP1_sgRNA4 
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của 
promoter U6 có kích thước khoảng 106 bp và các 
đoạn DNA chứa các GmHyPRP1_sgRNA(1-4) có kích 
thước khoảng 135 bp (Hình 4A). Tiếp theo, sản phẩm 
PCR tinh sạch của promoter U6 và các đoạn DNA 
của các sgRNA(1-4) được sử dụng cho phản ứng 
Golden gate. Trong đó, các sản phẩm PCR và vector 
tiếp nhận pICH47751 cùng được xử lý bởi enzyme 
giới hạn BsaI và phản ứng ghép nối được thực hiện 
nhờ sự có mặt của enzyme T4 DNA ligase. 
Các vector tái tổ hợp của phản ứng Golden gate 
cho mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được biến 
nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương 
pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn sau khi biến nạp được 
cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 20 
mg/L X-Gal kết hợp với 125 mg/L ampicillin và nuôi 
cấy qua đêm ở 37oC. Bốn khuẩn lạc màu trắng cho 
mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn 
để nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB lỏng có 
bổ sung 125 mg/L ampicilin để tách chiết thu DNA 
plasmid. Các vector tái tổ hợp cho mỗi 
U6:GmHyPRP1_sgRNA được cắt kiểm tra bằng 
enzyme giới hạn BpiI. 
Bảng 3. Kết quả giải trình tự các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) 
U6:GmHyPRP1_sgRNA1 U6:GmHyPRP1_sgRNA2 U6:GmHyPRP1_sgRNA3 U6:GmHyPRP1_sgRNA4 
tctgtGAAGACaaACTAga
attcccatggggagTgatcaaaa
gtcccacatcgatcaggtgatata
tagcagcttagtttatataatgata
gagtcgacatagcgattgCCA
GGCTTGTGCTTTTTGG
Ggttttagagctagaaatagcaa
gttaaaataaggctagtccgttatc
aacttgaaaaagtggcaccgagt
cggtgctttttttctagacccagctt
tcttgtacaaagttggcattacgct
TTACttGTCTTCtgcac 
TctgtGAAGACaaTTACg
aattcccatggggagTgatcaaa
agtcccacatcgatcaggtgatat
atagcagcttagtttatataatgat
agagtcgacatagcgattgGG
GGCATGTAGCCTGTG
Cgttttagagctagaaatagcaa
gttaaaataaggctagtccgttatc
aacttgaaaaagtggcaccgagt
cggtgctttttttctagacccagctt
tcttgtacaaagttggcattacgct
CAGAttGTCTTCtgcac 
CctgtGAAGACaaCAGAg
aattcccatggggagTgatcaaa
agtcccacatcgatcaggtgatat
atagcagcttagtttatataatgat
agagtcgacatagcgattgCCT
AGTTTGAGCGTGTCAA
Tgttttagagctagaaatagcaa
gttaaaataaggctagtccgttatc
aacttgaaaaagtggcaccgagt
cggtgctttttttctagacccagctt
tcttgtacaaagttggcattacgct
TGTGttGTCTTCtgcac 
CctgtGAAGACaaTGTGg
aattcccatggggagTgatcaaa
agtcccacatcgatcaggtgatat
atagcagcttagtttatataatgat
agagtcgacatagcgattgTAG
AGGGAGCAGGTGTAA
CCgttttagagctagaaatagca
agttaaaataaggctagtccgttat
caacttgaaaaagtggcaccgag
tcggtgctttttttctagacccagct
ttcttgtacaaagttggcattacgc
tGAGCttGTCTTCtgcac 
Chú thích: Chữ in đậm màu đỏ, vị trí enzyme giới hạn BsaI nhận biết; chữ in đậm màu xanh, vị trí cắt của 
enzyme giới hạn BsaI; chữ gạch chân, trình tự các sgRNA. 
Kết quả điện di cho thấy, với mỗi vector tái tổ 
hợp U6:GmHyPRP1_sgRNA sau khi cắt đều có 2 
vạch băng trên bản gel. Cụ thể, 1 băng có kích thước 
khoảng 4352 bp trùng với kích thước của vector 
pICH47751 và 1 băng có kích thước 237 bp được dự 
đoán là của các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) 
(Hình 4B). Như vậy, bước đầu cho thấy việc tách 
dòng và ghép nối các đoạn GmHyPRP1_sgRNA và 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 15 
promoter U6 vào vector tiếp nhận pICH47751 đã 
thành công. 
Tiếp theo, 2 trong số 4 khuẩn lạc dương tính với 
mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn 
để giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’-
GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy 
giải trình tự Sanger. 
Kết quả giải trình tự cho thấy, tất cả 4 vector 
pICH47751 có chứa các cassette 
U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) và đều mang trình tự 
chính xác của promoter U6 và theo sau là các 
GmHyPRP1_sgRNA(1-4) (Bảng 3). 
Tiếp theo, cả 4 vector pICH47751 chứa các 
cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) được sử dụng 
cho phản ứng Golden gate để ghép nối các cassette 
này vào vector binary pID. Sản phẩm tái tổ hợp của 
cấu trúc binary vector pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs 
được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10. Sau 
đó, dịch khuẩn được cấy trải trên đĩa LB có bổ sung 
50 mg/L kháng sinh kanamycin và nuôi qua đêm ở 
37oC. Ba khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiếp tục 
nuôi tăng sinh khối trong LB lỏng có bổ sung 50 
mg/L kanamycin cho tách chiết và tinh sạch phục vụ 
cho việc giải trình tự và cắt kiểm tra bằng enzyme 
giới hạn. 
Hình 5. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp 
pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs bằng enzyme giới hạn 
BamHI 
 Chú thích: M, 1Kb plus ladder; 1-3, DNA 
plasmid của các khuẩn lạc 
pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs 
Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp 
pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs bằng enzyme giới hạn 
BamHI (Hình 5) cho thấy, các sản phẩm cắt đều có 2 
băng; trong đó, 1 băng có kích thước khoảng 8210 bp 
có chứa vùng trình tự của 4 cassette 
U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4), trùng với kích thước dự 
đoán và 1 băng có kích thước khoảng 4039 bp có 
chứa trình tự của gen Bar và Cas9 (Hình 5). Để đảm 
bảo sự chính xác, hai trong số ba khuẩn lạc đã được 
lựa chọn để giải trình tự kiểm tra lại. Kết quả cho 
thấy, các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) có 
trình tự hoàn toàn chính xác như trình bày ở bảng 3 
và được sắp xếp như trong hình 6. 
Hình 6. Cấu trúc vector pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs 
và cassette chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen 
GmHyPRP1 
Chú thích: (A) Cấu trúc vector 
pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs. (B) Cassette chứa các 
sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1. LB, biên trái; 
NOSp-BAR-NOST, chỉ thị gen bar kháng glufosinate; 
2x35S-hSpCas9-tNOS, Cas9 được điều khiển bởi 
promoter 35S; U6:gRNA(1-4), vị trí lần lượt của các 
GmHyPRP1_sgRNA từ trái sang phải; RB, biên phải; 
pVS1, vùng bắt đầu sao chép; nptII, chỉ thị gen nptII 
kháng kanamycin 
Qua hình 6 cho thấy, vector binary pID có mang 
cassette cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 ở cây đậu 
tương được sắp xếp lần lượt từ vùng LB sang RB gồm 
có: 1 vùng chứa đoạn gen Bar, 1 vùng chứa Cas9 
được điều khiển bằng promoter 2x35S và 4 sgRNA 
được điều khiển bởi 4 promoter U6, cùng với đó hệ 
thống chọn lọc được sử dụng đối với vi khuẩn là 
kháng sinh kanamycin và thực vật là glufosinate. Với 
kết quả này, cấu trúc vector binary pID có chứa hệ 
thống CRISPR/Cas9 và các U6:GmHyPRP1_sgRNA 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 16 
(1-9) cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 ở cây đậu tương 
đã được thiết kế thành công. Cho đến nay, kỹ thuật 
chỉnh sửa gen sử dụng CRISPR/Cas9 được biết đến 
như là một trong những công cụ hữu ích trong việc 
nghiên cứu chức năng gen cũng như chỉnh sửa các 
gen liên quan tới các đặc tính nông sinh học, yếu tố 
cấu thành năng suất và tăng cường khả năng chống 
chịu với các stress sinh học và phi sinh học trên 
nhiều đối tượng cây trồng khác nhau (Bao et al., 
2019). Với việc thiết kế thành công hệ thống chỉnh 
sửa gen CRISPR/Cas9 cho gen GmHyPRP1, chúng 
tôi mong rằng sẽ sớm thu được các cây đậu tương 
chỉnh sửa gen GmHyPRP1 có khả năng tăng cường 
chống chịu các stress phi sinh học, từ đó mở ra 
hướng đi mới cho sản xuất đậu tương tại Việt Nam. 
4. KẾT LUẬN 
Các kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, hệ 
thống vector CRISPR/Cas9 chứa các sgRNA cho 
chỉnh sửa có định hướng gen GmHyPRP1 đã được 
thiết kế thành công. Sự thành công của nghiên cứu 
này sẽ là nguồn cung cấp hệ thống cấu trúc vector 
cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 nhằm cải thiện khả 
năng đáp ứng của cây đậu tương với các stress phi 
sinh học bằng phương pháp biến nạp gen thông qua 
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 
LỜI CẢM ƠN 
Công trình nghiên cứu được thực hiện trong 
khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu bước đầu tạo cây đậu 
tương tăng cường khả năng chịu hạn bằng kỹ thuật 
CRISPR/Cas9” theo Quyết định số 617/QĐ-KHNN-
KH ngày 31/7/2019 của Giám đốc Viện Khoa học 
Nông nghiệp Việt Nam về việc Phê duyệt danh mục 
các nhiệm vụ thường xuyên Phòng thí nghiệm Trọng 
điểm Công nghệ Tế bào thực vật thực hiện từ năm 
2019. Công trình nghiên cứu được đồng tài trợ bởi 
Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc (Mã số Đề tài 
NRF 2020M3A9I4038352 và 2020R1A6A1A03044344). 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Abdel Latef A., Jan S., Allah E., Rashid B., 
John R., Ahmad P. (2015). Soybean under abiotic 
stress. Proteomic approach, 28–42. 
2. Bao A., Burritt D. J., Chen H., Zhou X., Cao 
D., & Tran, L. P., 2019. The CRISPR/Cas9 system 
and its applications in crop genome editing. Crit Rev 
Biotechnol, 39(3): 321-336. 
3. Bartels D., Sunkar R. (2005). Drought and Salt 
Tolerance in Plants. Critical Reviews in Plant 
Sciences, 24(1): 23-58. 
4. Dvorakova L., Cvrckova F., and Fischer, L. 
(2007). Analysis of the hybrid proline-rich protein 
families from seven plant species suggests rapid 
diversification of their sequences and expression 
patterns. BMC Genomics, 8: 412. 
5. FAOSTAT (2019). Food and agriculture 
organization of the United Nations (FAO) statistical 
databases, Available at:  
Retrieved 10 august 2019. 
6. Jose-Estanyol M., Gomis-Ruth F. X., and 
Puigdomenech P. (2004). The eight-cysteine motif, a 
versatile structure in plant proteins. Plant Physiol. 
Biochem, 42, 355–365. 
7. Gain U (2018). Vietnam—oilseeds and 
products annual 2018, Global agricultural 
information network (Gain) report VM8018, USDA 
Gain, Hanoi, Vietnam. 
8. Hakeem U. R. K., Öztürk M., Ahmad P., 
Memon A. R. (2012). Biotechnology as an aid for 
crop improvement to overcome food shortage. Crop 
Production for Agricultural Improvement, 239-261. 
9. Li J., Ouyang B., Wang T., Luo Z., Yang C., Li 
H., Sima W., Zhang J., Ye Z. (2016). HyPRP1 gene 
suppressed by multiple stresses plays a negative role 
in abiotic stress tolerance in tomato. Frontiers in 
Plant Science, 7: 967. 
10. Manavalan L. P., Guttikonda S. K., Tran L. S., 
Nguyen, H. T. (2009). Physiological and molecular 
approaches to improve drought resistance in 
soybean. Plant Cell Physiol, 50(7): 1260-1276. 
11. Werner S., Engler C., Weber E., Gruetzner 
R., Marillonnet S. (2012). Fast track assembly of 
multigene constructs using Golden Gate cloning and 
the MoClo system. Bioeng Bugs, 3(1): 38-43. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 17 
CONSTRUCTION OF THE CRISPR/Cas9 VECTOR SYSTEM FOR EDITING GmHyPRP1, A 
SOYBEAN GENE RELATES TO MULTIPLE ABIOTIC STRESS TOLERANCE 
 Nguyen Huu Kien1,a, Vu Van Tien1,2,a, Nguyen Trung Anh1, 
Le Thi Mai Huong1, Doan Thi Hai Duong2, Dinh Thi Mai Thu1, 
Nguyen Thi Hoa1, Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, 
Pham Xuan Hoi1, Jae-Yean Kim2,*, Nguyen Van Dong1,* 
1National Key Laboratory for Plant Cell Biotechnology, Agricultural Genetics Institute, Vietnam 
Academy of Agricultural Sciences, Hanoi, Vietnam 
2Division of Applied Life Science (BK21 program), Plant Molecular Biology and Biotechnology 
Research Center, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea. 
aEqually contributed 
*Email: kimjaeyean@gmail.com; dongjircas@yahoo.com 
Summary 
Abiotic stresses such as, drought, high soil salinity, cold, high temperature, and heavy metal toxicity are 
commonly adverse environmental conditions that affect and limit crop productivity worldwide. Soybean 
(Glycine max L.) is also one of the plants severely affected by abiotic stresses. Recently, the CRISPR/Cas9-
based genome editing technology is known as a useful tool for precisely editing genes of interests in plants. 
GmHyPRP1 has been predicted as a negative regulator gene for abiotic stresses and may play an important 
role in improving plant response to abiotic stresses by inactivating or loss-of-function of this gene. Thus, we 
conducted constructing a vector system for expressing CRISPR/Cas9 and sgRNAs for editing of 
GmHyPRP1 gene with the aim of improving soybean plants that could tolerate mutiple abiotic stresses. 
Keywords: Abiotic stress, CRISPR/Cas9, HyPRP protein, PCR, soybean, multi-stress tolerance. 
Người phản biện: TS. Nguyễn Xuân Thắng 
Ngày nhận bài: 14/7/2020 
Ngày thông qua phản biện: 14/8/2020 
Ngày duyệt đăng: 21/8/2020