Quy trình công nghệ sản xuất Alkyl glycerol từ sinh vật biển dùng và tạo thực phẩm chức năng Akumarin

Thủy sản 
của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 
đến 2020.
II.	PHƯƠNG	PHÁP	NGHIÊN	CỨU
2.1.	 Chuẩn	 bị	 dung	 dịch	 DA: Hòa tan 2 
mg domoic acid (DA) chuẩn (TOCRIS, Anh 
14277-97-5) trong 1 thể tích nhỏ nước cất (<1 
ml); hiệu chỉnh pH 6-7 bằng dung dịch Natri 
Cacbonate (Na
2
CO
3
) 1M.
ngẫu nhiên với phân tử protein tải nên kháng 
thể sản sinh sẽ ở dạng hỗn hợp 03 kháng thể 
tương ứng với 03 điểm tiếp nhận khác nhau 
của phân tử DA. Mặt khác, hàm lượng kháng 
thể tạo ra từ kháng nguyên được điều chế bằng 
phương pháp này cũng rất ít và lẫn nhiều tạp 
chất không mong muốn.
Nhằm cải thiện chất lượng kháng thể 
(có tính đặc hiệu hơn), Garthwaite và ctv., 
(1998) đã phát triển phương pháp tạo kháng 
nguyên bằng cách gắn gốc amine của DA với 
gốc cacboxyl của protein tải. Ở phương pháp 
này, với 01 gốc amine tự do duy nhất của DA, 
kháng nguyên hoàn toàn tương đồng về điểm 
tiếp nhận của DA do đó sẽ giảm thiểu được tạp 
chất không mong muốn trong sản phẩm miễn 
dịch. Mặc dù vậy, do các protein mang thường 
có rất nhiều nhóm cacboxyl trên bề mặt phân 
tử, chất lượng kháng thể còn phụ thuộc vào 
tỉ lệ gắn kết thành công giữa số lượng phân 
tử DA nhất định với một phân tử protein tải. 
Bằng phương pháp này, kháng thể sản sinh ra 
có sản lượng và tính đặc hiệu cao hơn hẳn so 
với Smith và Kitts (1994). Tuy nhiên, do DA 
chỉ có nhóm amine thứ cấp (-NH) nên cần phải 
chuyển đổi sang dạng amine sơ cấp (-NH
2
) 
trước khi tạo phức kháng nguyên có thể làm 
hao hụt đi phần nào kháng nguyên sau điều 
chế nên quy trình thực hiện này lại quá phức 
tạp và tốn kém. 
Một phương pháp khác có thể sử dụng 
để điều chế phức hợp kháng nguyên là gắn kết 
gốc amine sơ cấp của phân tử DA với chính 
gốc amine sơ cấp của phân tử protein tải. Để 
thực hiện được phản ứng gắn kết này, cần có sự 
tham gia của hợp chất mang tính cầu nối giữa 
02 phân tử. Disuccinimidyl Suberate (DSS, 
C
16
H
20
N
2
O
8
) là một hợp chất có khả năng liên 
kết giữa nhóm amine sơ cấp của DA và nhóm 
nitrate (-NO
3
) của phân tử DSS, sau đó phức 
này được kết hợp với nhóm amine sơ cấp của 
phân tử protein thông qua nhóm cacboxyl của 
phân tử DSS tạo thành phức hợp kháng nguyên 
DA-DSS-protein. Phương pháp này đơn giản 
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
128 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
serum, WAKO, Nhật Bản, 016-15133)/Plys 
(Polylysin, WAKO, Nhật bản 513-74891) 
trong 200 µl dung dịch đệm PBS (Phosphate 
Buffer Saline) 0,1 M - dung dịch này có nồng 
độ 25 mg protein tải/ml. 
2.5.	Tạo	phức	giữa	DA-DSS	và	protein	tải:	
Trộn hỗn hợp DA-DSS và dung dịch protein 
tải trong PBS, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 
2 giờ, sau đó thẩm tích qua đêm (lặp lại 3 lần) 
ở 40C (giữ trong tủ lạnh) bằng 1.000 ml dung 
dịch đệm PBS 0,1 M nhằm loại bỏ DA và DA-
DSS không tham gia phản ứng. Dung dịch sau 
thẩm tích chứa DA-DSS-KLH/BSA/Polylysin 
được đưa về tổng thể tích 08 ml bằng dung 
dịch đệm PBS 0,1 M. Dung dịch cuối cùng 
này có nồng độ protein tải phản ứng với 1 mg 
DA ban đầu là 250 µg/ml. 
2.2.	Chuẩn	bị	dung	dịch	DSS: Hòa tan 20 mg 
Disuccinimidyl Suberate (DSS) (THERMO, 
Mỹ, 68528-80-3) trong 1,6 ml DMF (N,N-
dimethylformamide) (WAKO, Nhật Bản 048-
27585).
2.3.	Tạo	phức	DA-DSS: Trộn dung dịch DA 
và dung dịch DSS, lắc đều, sau đó để yên ở 
nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Thêm vào hỗn 
hợp này một thể tích nhỏ dichloruamethal 
(CH
2
Cl
2
), lắc đều để lắng cho đến khi phân 
thành 02 lớp chất lỏng (lớp dưới bao gồm DSS 
và DMF dư thừa; lớp trên bao gồm nước cất 
có chứa DA-DSS). Loại bỏ lớp dưới, giữ lại 
lớp trên bằng phễu chiết, dùng khí N
2
 để loại 
dichloruamethal.
2.4.	Chuẩn	bị	dung	dịch	protein	tải	(KLH/	
BSA/	 Polylysin):	 Hòa tan 5 mg KLH 
(Keyhole Limpet Hemocyanin, DAKO, 
Nhật bản 517-39611)/BSA (Albumin, bovine 
Hình 1: Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA thông qua cầu nối DSS gắn nhóm imino 
(-NH) của DA và gốc amine (-NH
2
) của protein tải
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 129
hợp kháng nguyên sau cộng hợp với cùng 01 
lượng DA (2 mg) thông qua cầu nối DSS được 
trình bày trong Bảng 2.
- Tính toán hàm lượng protein tải (KLH/
BSA/Polylysin) trên cơ sở so sánh với dung 
dịch protein chuẩn 1 mg/ml trong đệm PBS 
0,1 M.
III.	KẾT	QUẢ	
3.1.	 Hiệu	 suất	 của	 phản	 ứng	 giữa	 DA	 và	
DSS
Hàm lượng DA tham gia phản ứng tạo 
phức DA-DSS được trình bày ở Bảng 1. Hiệu 
suất phản ứng có khoảng dao động từ 65% 
đến 68% so với lượng DA sử dụng ban đầu, và 
không có sự sai khác thống kê giữa 03 lần thí 
nghiệm. Như vậy, hiệu suất phản ứng của quy 
trình gắn kết giữa DA và DSS là khá ổn định 
giữa 03 lần thí nghiệm.
2.6.	Xác	định	hiệu	suất	tạo	phức	của	phức	
DA-DSS: Xác định hàm lượng DA dư thừa 
sau phản ứng DS-DSS trong hỗn hợp bằng 
phương pháp HPLC cho phân tích độc tố DA 
theo Kodama và Kotaki (2005).
2.7.	Xác	định	hiệu	suất	tạo	phức	của	phức	
DA-DSS-KLH/BSA/Polylysin
- Đo cường độ màu của DA có mặt trong 
phức hợp DA-DSS-protein thu nhận sau thẩm 
tích ở bước sóng 242 nm với mẫu trắng là đệm 
PBS 0,1 M.
- Tính toán hàm lượng DA trong phức 
hợp trên cơ sở so sánh với dung dịch DA chuẩn 
250 µg/ml trong đệm PBS 0,1 M.
- Đo cường độ màu của protein tải có 
mặt trong phức hợp DA-DSS-protein (sau 
thẩm tích) ở bước sóng 280 nm; 
Thí nghiệm Hàm lượng DA (mg) 
ban đầu
Hàm lượng DA (mg) tham 
gia phản ứng
Hiệu suất phản ứng
1 2,0 1,30 65%
2 2,0 1,36 68%
3 2,0 1,30 65%
Bảng 1. Hàm lượng DA trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất phản ứng
3.2.	Hiệu	suất	phản	ứng	cộng	hợp	giữa	DA-
DSS	và	protein	tải
Kết quả xác định hàm lượng 03 protein 
tải bao gồm KLH, BSA và Plys trong phức 
STT Phức hợp kháng 
nguyên
Hàm lượng protein 
(mg) sử dụng cộng hợp
Hàm lượng protein 
(mg) trong phức 
hợp kháng nguyên
Hiệu suất phản ứng 
(%)
1 Plys-DSS-DA1 5,0 0,710 14,2
2 BSA-DSS-DA2 5,0 1,025 20,5
3 KLH-DSS-DA3 5,0 0,088 7,15
Bảng 2. Hàm lượng protein trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein và hiệu suất phản 
ứng
Ghi chú: Plys: Polylysin, BSA: Bovine Serum Albumin, KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin
DA 1, DA 2, DA 3: DA của từng thí nghiệm kết hợp DA-DSS (Bảng1)
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
130 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
Từ kết quả tính toán hàm lượng DA trước 
và sau phản ứng, số phân tử DA tham gia phản 
ứng tạo phức với 01 phân tử protein tải được 
trình bày trong Bảng 3. Theo kết quả bảng này, 
59 trong tổng số 79 gốc lysine của Plys, 22 
trong tổng 39 gốc lysine của BSA đã gắn kết 
với DA, trong khi ở Plys, chỉ có 14 trong tổng 
số 735 gốc lysine kết hợp thành công. 
với DA do chúng cũng bị che khuất khi hòa 
tan trong môi trường đệm (giống như trường 
hợp của KLH). Khác với 02 protein trên, BSA 
có khối lượng phân tử nhỏ hơn hẳn (khoảng 
65.000 đ.v.c), nhưng lại có tính tan tốt trong 
đệm PBS. Trong thực nghiệm, 22 gốc lysine 
của BSA đã kết hợp thành công với DA trong 
phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA. Kết 
quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu 
của Huang và ctv., (2004) chứng minh rằng 
một phân tử BSA có chứa 35 gốc lysine tự do 
nhưng chỉ có khoảng 22-24 gốc có thể gắn kết 
đặc hiệu với phân tử DA. Như vậy, có thể đánh 
giá rằng trong 03 protein thử nghiệm, BSA có 
hiệu suất gắn kết tốt nhất với DA.
Ngoài ra, nguồn gốc của protein tải đóng 
vai trò quan trọng trong cơ chế gây miễn dịch 
đối với sinh vật thử nghiệm. Thông thường, 
hệ miễn dịch sẽ nhạy cảm hơn đối với kháng 
nguyên có đặc tính lạ, do đó các protein có 
nguồn gốc xa với động vật gây miễn dịch 
thường cho hiệu giá kháng thể cao hơn. KLH 
có nguồn gốc từ loài ốc đá (Giant Keyhole 
Limpet Megathura crenulata) phân bố giới 
Kết quả cho thấy, hiệu suất thực nghiệm 
tính theo hàm lượng protein tham gia phản 
ứng dao động từ 14,2-20,5% tùy theo protein 
khác nhau. Hiệu suất cao nhất được ghi nhận ở 
BSA (20,5%), tiếp theo là Plys (14,2%), trong 
khi KLH lại có hiệu suất thấp nhất (7,15%).
3.3.	Hệ	số	kết	hợp	của	DA	với	01	phân	tử	
protein
STT Phức hợp Số gốc lysine tự do 
trong 1 phân tử protein 
Số phân tử DA kết hợp 
với 1 phân tử protein 
1 Plys-DSS-DA 79 (*) 59
2 BSA-DSS-DA 35 (**) 22
3 KLH-DSS-DA 735 (***) 14
Bảng 3. Số phân tử DA trong các phức hợp kháng nguyên cộng hợp với KLH, BSA và Plys
Ghi chú: 
Plys: Polylysin; BSA: Bovine Serum Albumin; KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin
(*): theo Brian và ctv., 1996; (**): theo Huang và ctv., 2004; (***): theo Dolaski và ctv., 2005
IV.	THẢO	LUẬN
Xét về mặt khối lượng phân tử, KLH 
là một protein glycosyl hóa rất lớn với khối 
lượng phân tử 4.500.000-13.000.000 đ.v.c. 
Thông thường, protein có khối lượng phân 
tử càng lớn sẽ có càng nhiều gốc lysine tự do 
đóng vai trò là epitope (điểm tiếp nhận) trong 
phản ứng tạo phức với DA-DSS nên sẽ tăng 
khả năng cao hơn tạo ra các kháng thể. Dolaski 
và ctv., (2005) xác định có 739 gốc lysine tự 
do trong phân tử KLH. Tuy nhiên, các phân 
tử KLH lại có xu hướng tập hợp lại và kết tủa 
khi hòa tan trong môi trường đệm PBS. Do đó, 
các nhóm lysine tự do có nguy cơ bị che khuất, 
dẫn đến hạn chế khả năng liên kết với phân tử 
DA. Đây chính là nguyên nhân dẫn đến hiệu 
suất và hệ số kết hợp giữa các gốc lysine tự do 
của KLH với DA không cao trong thí nghiệm. 
Plys có khối lượng phân tử 150.000-300.000 
đ.v.c, với 79 gốc lysine tự do trong cấu trúc 
phân tử. Kết quả thí nghiệm cho thấy protein 
này có tỉ lệ gắn kết giữa gốc lysine và phân 
tử DA cao nhất trong 03 protein thử nghiệm. 
20 gốc lysine trong Plys không gắn kết được 
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 131
Hemocyanin. World Journal of Agricultural 
Sciences 1 (2): 129-136. 
Garthwaite, I., Ross, K.M., Miles, C.O., Hansen, 
R.P., Foster, D., Wilkins, A.L., and Towers, 
N.R., 1998. Polyclonal Antibodies to Domoic 
Acid, and Their Use in Immunoassays for 
Domoic Acid in Sea Water and Shellfish. 
Natural Toxins 6: 93-104.
Huang, B.X., Kim, H-Y., and Dass, C., 2004. 
Probing Three-Dimensional Structure of 
Bovine Serum Albumin by Chemical Cross-
Linking and Mass Spectrometry. J Am Soc 
Mass Spectrom. 15: 1237–1247.
Kania, M., and Hock, B., 2002. Development of 
monoclonal antibodies to domoic acid for 
the detection of domoic acid in blue mussel 
(Mytilus edulis) tissue by ELISA. Analytical 
Letters: Chemical and Bio-sensors 35(5): 
855-868.
Kania, M., Kreuzer, M., Moore, E., Pravda, 
M., Hock, B., and Guilbault, G., 2003. 
Development of Polyclonal Antibodies 
against domoic acid for their use in 
electrochemical biosensors. Analytical 
Letters 36(9): 1851-1863.
Kawatsu, K., Hamano, Y., Noguchi,T., 1999. 
Production and characterization of a 
monoclonal antibody against domoic acid 
and its application to enzyme immunoassay. 
Toxicon 37: 1579-1589.
Newsome, H., Truelove, J., Hierlihy, L., and 
Collins, P., 1991. Determination of Domoic 
Acid in Serum and Urine by Immunochemical 
Analysis. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 
47: 329-334.
Osada, L., Marks, J., Stewart, J.E., 1995. 
Determination of Domoic Acid by Two 
Different Versions of a Competitive Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Bull. 
Environ. Contam. Toxicol. 54: 797-804.
Smith, D.S., and Kitts, D.D., 1994. A competitite 
Enzyme-linked Immunoassay for domoic 
acid determination in human fluid. Fd. 
Chem. Toxic. 32 (12): 1147-1154.
Smith, D.S., and Kitts, D.D., 1995. Enzyme 
immunoassay for the determination of 
domoic acid in mussel extracts. J. Agric. 
Food. Chem.43: 367-371.
hạn ở một số vùng thuộc ven biển Thái Bình 
Dương, BSA là protein nguồn gốc từ động vật 
móng guốc (bò), và Plys có nguồn gốc từ tế 
bào cơ thể người. Như vậy, khi gây miễn dịch 
ở đối tượng thỏ trắng New Zealand, KLH có 
tính sinh miễn dịch tốt nhất so với 02 protein 
còn lại. Tuy nhiên, tính theo hệ số gắn kết giữa 
DA và protein, số phân tử DA kết hợp với 
KLH lại quá nhỏ. Kháng thể tạo ra bằng liệu 
pháp miễn dịch khi sử dụng phức hợp kháng 
nguyên này sẽ không đạt được tính đặc hiệu 
cao với DA, do đó, không đáp ứng yêu cầu sử 
dụng cho tạo kít ELISA.
V.	KẾT	LUẬN
Kết hợp giữa kết quả thực nghiệm và 
nguyên lý miễn dịch, BSA được chọn lựa làm 
protein tải để điều chế phức hợp kháng nguyên 
từ bán kháng nguyên DA để sử dụng gây miễn 
dịch ở thỏ trắng New Zealand nhằm thu nhận 
kháng thể đặc hiệu kháng DA. 
LỜI	CẢM	ƠN
Công trình này thuộc nội dung khoa học 
của đề tài KHCN cấp Nhà nước 2013-2015 
"Nghiên cứu phát triển bộ KIT phát hiện nhanh 
một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy sản" 
trong chương trình Công nghệ Sinh học Thủy 
sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông 
thôn đến 2020. 
TÀI	LIỆU	THAM	KHẢO
Branna, P., Naar, J., Chinain, M., Pauillac, S., 
1999. Preparation and characterization of 
domoic acid - protein conjugates using a 
small amount of toxin in a reversed micellar 
medium: Application in Competitive Enzyme 
linked Immunosorbant Assay. Bioconjugate. 
Chem. 10: 1137-1142.
Brian, L. F., and Corn, R.M.,1996. Covalent 
Attachment and Derivatization of Poly 
(L-lysine) Monolayers on Gold Surfaces As 
Characterized by Polarization-Modulation FT-
IR Spectroscopy. Anal. Chem. 68: 3187-3193.
Dolashki, A., Schütz, J., Hristova, R., Voelter, 
W., and Dolashka, P., 2005. Spectroscopic 
Properties of Non-glycosilated Functional 
Unit KLH2-c of Keyhole Limpet 
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
132 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
MAKING ANTIGEN FROM A HAP TEN DOMOIC ACID
Dao Viet Ha1* and Pham Xuan Ky1
ABSTRACT
With the aim to select the appropriate carrier protein for DA-antigen, a hap ten DA was 
coupled with 03 different carrier proteins e.g. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Bovine 
Serum Albumin (BSA) and Polylysin (Plys) via chemical substrate of Disuccinimidyl 
Suberate (DSS). Productivity of a reaction between DA and DSS (pH 6-7, room temperature) 
was stable (65-68%). In contrast, there was the difference in productivity among 03 carrier 
proteins reacted with DA-DSS: BSA showed highest productivity (20.5%), following were 
KLH (7.15%) and Plys (14.2%). In the antigen compound, a coupling ratio between DA 
and each protein was also different (Plys:59, BSA: 22, KLH: 14). Based on the information 
about free lysin number in protein structure, BSA is considered more advantage in both 
productivity and coupling ratio, therefore, it is selected to be as a carrier protein for DA 
antigen in order to produce specific DA-antibody in New Zealand rabbit in Vietnam. 
Keywords: domoic acid, productivity, antigen, carier protein.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015
Ngày duyệt đăng: 07/8/2015
1Institute of Oceanography, Vietnam Academy of Science and Technology
*Email: daovietha69@gmail.com