Phát triển quy trình đặc hiệu PCR chẩn đoán IHHNV cho type lây nhiễm trên tôm sú nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long

Í NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
virus IHHN type lây nhiễm có kích thước (295 
bp). Các mẫu còn lại không có tín hiệu. Chứng 
tỏ quy trình mới với cặp mồi thiết kế phản ứng 
đặc hiệu cho virus IHHNV, không khuếch đại 
bộ gen của các virus HPV, MBV, NHP, WSSV, 
IHHNV type A đã xác định được ở trên, Vibrio 
sp là những virus, vi khuẩn thường gặp trên tôm. 
Vậy trong phạm vi nghiên cứu này, quy trình 
hoàn toàn đặc hiệu với IHHNV type lây nhiễm.
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu của quy 
trình PCR đã tối ưu. M: thang DNA 100 bp; Mẫu (+): mang DNA virus IHHN; giếng1: IHHNV 
typeA/B; giếng 2: HPV; giếng 3: WSSV; giếng 4: Vibrio.sp; giếng 5: NHP.
295 bp
3.6. Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây 
nhiễm trên mẫu thực
Tiến hành áp dụng quy trình trên 160 mẫu 
tôm thương phẩm, 116 mẫu tôm giống, 15 mẫu 
tôm bố mẹ. Trong số 160 mẫu tôm thương 
phẩm trên có 26 mẫu cho kết quả dương tính 
với IHHNV type lây nhiễm, 116 mẫu tôm 
giống thì cho kết quả dương tính 31 mẫu. Trên 
tôm bố mẹ thì 4 trong tổng số 15 mẫu cho kết 
quả dương tính với IHHNV type lây nhiễm. 
Kết quả của các thí nghiệm kiểm tra độ nhạy, 
độ đặc hiệu và ứng dụng quy trình kiểm tra 
IHHNV type lây nhiễm trên mẫu thực khẳng 
định: đã phát triển thành công quy trình PCR 
phát hiện IHHNV type lây nhiễm tại phòng 
thí nghiệm. Quy trình PCR đã tối ưu có thể áp 
dụng trong thực tế. Nghiên cứu đã chỉ rõ tính 
khả dụng của quy trình, mức độ nhiễm virus 
IHHNV có thể phát hiện (4 bản sao DNA virus/
μl dịch ly trích) và quy trình đặc hiệu với virus 
IHHNV type lây nhiễm.
THẢO LUẬN
Quản lý bệnh do virus trên nuôi tôm là một 
thách thức của ngành nuôi tôm công nghiệp vì 
thiếu các phương pháp phát hiện độ nhạy cao 
và đặc hiệu. Những năm gần đây, chẩn đoán 
sự hiện diện virus trong tôm nuôi chủ yếu dựa 
trên phương pháp sinh học và mô học, bao gồm 
lai tạo tại chỗ sử dụng đoạn gen đặc hiệu. Giới 
hạn phát hiện của những phương pháp này có 
độ nhạy thấp so với PCR mất nhiều thời gian. 
Những báo cao gần đây cho thấy sự hiện diện 
của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của 
tôm sú thì việc chẩn đoán IHHNV rất phức tạp 
bởi các biến thể di truyền của virus trong các 
khu vực địa lý khác nhau (Tang và Lightner., 
2006). Do đó việc lựa chọn quy trình PCR 
ứng dụng trên tôm sú phải được cân nhắc do 
có sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền 
giữa các type IHHNV (trình tự 2.9 kb nucleoti-
de của type A/B không lây nhiễm tương đồng 
90−96% so với 4.1 kb của type IHHNV lây 
nhiễm) (Saksmerprome và ctv., 2010). Một số 
kết quả gần đây ở Úc và Châu Phi khi nghiên 
114 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
cứu một đoạn DNA IHHNV trên P. monodon 
cho thấy có sự tích hợp IHHNV type A/B trong 
hệ gen của chúng (Tang và Lightner., 2006). Do 
đó xét nghiệm PCR có thể cho kết quả dương 
tính giả đối với virus truyền nhiễm IHHNV type 
lây nhiễm trên P. monodon nếu mồi được thiết 
kế thuộc khu vực IHHNV type A/B chèn vào 
hệ gen tôm (Tang và ctv., 2003; Krabsetsve và 
ctv., 2004; Tang và Lightner., 2006). Như vậy 
kết quả phân tích không thể phân biệt được mẫu 
mang virus IHHN có khả năng gây bệnh (type 1, 
type 2) hay mẫu mang IHHNV không gây bệnh 
(type A/ B). Điều này ảnh hưởng đến khâu chọn 
con giống ban đầu, giá trị thương phẩm của tôm 
nuôi. Gần đây một số quy trình PCR cho phép 
phát hiện và phân biệt IHHNV truyền nhiễm 
trên tôm sú dựa trên việc thiết kế mồi khuếch 
đại vùng vật liệu di truyền không có ở IHHNV 
type A/B (Tang và ctv., 2007; Saksmerprome và 
ctv., 2010). Tổ chức sức khỏe động vật thế giới 
(OIE., 2009) cũng đưa ra nhiều quy trình chẩn 
đoán IHHNV gây bệnh và không gây bệnh. 
Hiện nay cặp mồi khuếch đại IHHNV là 309F/R 
(Tang và ctv., 2007), 77012F/77353R (OIE., 
2009) và cặp mồi IHHNV 279F/940R (Saks-
merprome và ctv., 2010) phát hiện IHHNV type 
truyền nhiễm được đánh giá cao. Tuy nhiên theo 
phân tích của Tang và ctv (2007) thì cặp mồi 
IHHNV 309F /R có những trình tự nucleotide 
ở đầu 3’ có thể bắt cặp được với type A hoặc 
type B. Thêm vào đó, sự chèn trình tự IHHNV 
ngẫu nhiên vào bộ gen tôm sú thường xảy ra mà 
những cặp mồi do 309F/R và IQ 2000 của Đài 
Loan có thể bắt cặp trong phản ứng. Dẫn đến 
kết quả chẩn đoán dương tính giả khi sử dụng 
cặp mồi này hoặc bộ kít nested IQ2000TM (Saks-
merprome và ctv., 2011). Một nghiên cứu khác 
ở Ấn Độ cho thấy khi sử dụng cặp mồi IHHNV 
77012F/77353R để khuếch đại DNA IHHNV 
type lây nhiễm, khi phân tích lai 2 cặp mồi này 
với trình tự IHHNV type B hoặc type A, kết quả 
cho thấy mồi xuôi tương đồng với type B 100% 
và chỉ khác biệt có 4 nucleotide so với type A, 
khi đó mồi ngược tương đồng rất cao với type 
A và type B và chỉ có 1 nucleotide khác biệt, 
thêm vào đó cặp mồi IHHNV 77012F/77353R 
được phỏng đoán là không đủ nhạy để phát hiện 
tất cả các biến thể di truyền của IHHNV (Rai 
và ctv., 2009). Ngoài ra theo nghiên cứu của 
Úc, khi xét nghiệm PCR chẩn đoán IHHNV với 
cặp mồi IHHNV 279F/940R (Saksmerprome và 
ctv., 2010), với kích thước sản phẩm khuếch đại 
là 662 bp. Tuy nhiên, sản phẩm khuếch đại thu 
được có kích thước là 496 bp. Dựa trên gen mục 
tiêu ở vị trí 279 − 940 của chuỗi trình tự IHHNV 
AF218266, mà từ đó các mồi được thiết kế. Sau 
khi phân tích trình tự AF218266 đã phát hiện 
một đoạn trình tự trùng lặp có kích thước 165 bp 
bắt đầu từ vị trí 363 và kết thúc ở vị trí 693 (tức 
là 2 × 165 = 330 bp tổng chiều dài). Cho nên 
khi đọc kết quả dễ bị sai khi kích thước khuếch 
đại không cho ra chính xác như mong đợi, ảnh 
hưởng đến kết quả chẩn đoán bệnh. Do đó trong 
đề tài này chúng tôi phát triển quy trình PCR 
mới chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm với cặp 
mồi tự thiết kế IHHNVvn F2/R1, không thuộc 
vùng trình tự tương đồng với IHHNV type A/B, 
nhằm phát triển quy trình chẩn đoán IHHNV 
đặc hiệu type lây nhiễm, có độ nhạy cao.
Giới hạn phát hiện đóng vai trò quan trọng 
trong phát triển các quy trình PCR chẩn đoán 
bệnh virus. Thông thường các kỹ thuật PCR 
115TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
một bước cho phép phát hiện số lượng DNA 
IHHNV trong mẫu trên một phản ứng là khoảng 
200 bản sao (Dhar và ctv., 2001). Thêm vào đó, 
sự ảnh hưởng nồng độ DNA đến độ nhạy của 
phản ứng. Vì vậy để khảo sát giới hạn phát hiện 
của phản ứng PCR thiết kế, chúng tôi tiến hành 
kiểm tra độ nhạy của phản ứng và thử nghiệm 
được lặp lại 2 lần. Lần 1, tiến hành phản ứng 
PCR quy trình mới với dãy pha loãng Plasmid 
pGEM T-easy - IHHNV trong nước khử ion. 
Lần 2, chúng tôi lặp lại thí nghiệm lần 1 trên với 
dãy pha loãng tương tự trong dung dịch ly trích 
DNA tôm không mang virus IHHNV đã chuẩn 
bị. Kết quả cho thấy qui trình PCR có thể phát 
hiện ở độ nhạy 4 bản sao DNA IHHNV/ phản 
ứng mẫu trên cả 2 mẫu pha loãng ở nước cất. 
Tuy nhiên trên mẫu DNA IHHNV pha loãng 
trong DNA tôm có độ sáng bang vạch không rõ 
hơn (hình 5 và 6) so với DNA pha loãng trong 
nước. Kết quả trên cho thấy, khi pha loãng mẫu 
trong nước độ nhạy phản ứng cao hơn pha loãng 
trong DNA tôm không nhiễm virus IHHNV. 
Nguyên nhân có thể do trong nước không có 
DNA của tôm còn trong mẫu tôm không bệnh 
vẫn tồn tại DNA từ tôm. Khi pha loãng plas-
mid-DNA IHHNV type lây nhiễm với dịch ly 
trích mẫu không bệnh, tổng lượng DNA ban đầu 
trong một phản ứng sẽ tăng lên gây trở ngại cho 
phản ứng PCR. Còn pha loãng trong nước khử 
ion, tổng lượng plasmid-DNA IHHNV ban đầu 
trong hỗn hợp pha loãng giảm xuống, tạo điều 
kiện môi trường thuận lợi cho phản ứng diễn ra, 
do đó làm độ nhạy quy trình tăng lên. Vậy có 
thể nói nồng độ DNA tôm cao ảnh hưởng đến 
độ nhạy phản ứng. Do đó khi ly trích DNA virus 
làm thí nghiệm cần chú ý đến lượng DNA tôm 
trong mỗi phản ứng. 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã phát triển thành công quy 
trình PCR chẩn đoán IHHNV đặc hiệu cho type 
lây nhiễm trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL bằng hóa 
chất hiện có tại phòng thí nghiệm. Nghiên cứu 
cũng đã xác định được độ đặc hiệu của quy trình 
và độ nhạy cao. Bên cạnh đó, chúng tôi đã dòng 
hóa được plasmid mang gene IHHNV có kích 
thước 2590 bp dùng cho khảo sát cho quy trình 
PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm mà OIE 
(2009) công bố và đồng thời dùng làm bản mẫu 
dương cho quy trình mới thiết kế. Với quy trình 
PCR mới phát triển có thể phát hiện 4 bản sao 
DNA IHHNV type lây nhiễm trong một phản 
ứng khuếch đại. Có thể áp dụng quy trình trong 
thực tế để phát hiện IHHNV type lây nhiễm trên 
tôm nuôi. Ngoài ra trong nghiên cứu đã chứng 
minh nồng độ DNA tôm ảnh hưởng đến độ nhạy 
phản ứng của quy trình mới phát triển.
So sánh đánh giá quy trình PCR thiết kế 
và quy trình OIE (2009) công bố với cặp mồi 
77012F/77353R, nested IQ 2000 (Đài Loan) để 
chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm, thì quy trình 
thiết kế có độ nhạy tương đương với quy trình 
OIE công bố và bộ kít nested IQ 2000.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phạm Văn Hùng, Nguyễn Tẫn Bình, Nguyễn Đăng 
Ninh, Phạm Hùng Vân, Phạm Thành Hổ. 2009. 
Sự phổ Biến của Virus Gây Bệnh Hoại Tử Dưới 
Vỏ Và Cơ Quan Tạo Máu Trên Tôm Sú Nuôi Tại 
Việt Nam. Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh. Tập 
13 (2). Trang 234-238
Phan Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng; Hoàng Hiếu 
Ngọc, Phạm Hùng Vân. 2009. Giải Trình Tự Bộ 
Gen Infectious Hypodermal And Haematopoietic 
116 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Necrosis Virus (IHHNV) Gây Bệnh Hoại Tử Trên 
Tôm. Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh. Tập 13 (2). 
Trang 129-137.
Bonami J.R, Trumper B, Mari J, Brehelin M, 
and Lightner D.V., 1990. Purification and 
characterization of IHHN virus of penaeid 
shrimps. J. Gen. Virol; 71, 2657–2664.
Krabsetsve K; Cullen B.R., Owens L., 2004. 
Rediscovery of the Australian strain ofinfectious 
hypodermal and haematopoietic necrosis virus. 
Dis. Aquat. Org. 61, 153–158.
Dhar, A.K., Roux, M.M., Klimpel, K.R., 2001. 
Detection and quantifi-cation of infectious 
hypodermal and hematopoietic necrosis virus 
and white spot virus in shrimp using real-time 
quantitative PCR and SYBR green chemistry. J. 
Clin. Microbiol. 39 (8), 2835–2845
Mari J, Bonami J.R., Lightner D.V., 1993. Partial 
cloning of the genome of infectious hypodermal 
and hematopoietic necrosis virus, an unusual 
parvovirus pathogenic for penaeid shrimps; 
diagnosis of the disease using a specific probe. J. 
Gen. Viro, 74, 2637–2643.
OIE, 2009. Diagnostic Manual for Aquatic Animal 
Diseases 6th Edition. Office International des 
Epizooties (OIE), Paris. Chapter 2.2.2. Infectious 
Hypodermal and Hematopoietic Necrosis. pp. 78-
95
Rai, Pradeep, Safeena, Karunasagar I, Karunasagar 
I., 2009. Simultaneous presence of infectious 
hypodermal and hematopoietic necrosis virus 
(IHHNV) and Type A virus-related sequence in 
Penaeus monodon from India. Aquaculture, 295, 
168–174.
Saksmerprome V, Puiprom O., Noonin C., Flegel T.W., 
2010. Detection of infectious hypodermal and 
haematopoietic necrosis virus (IHHNV) in farmed 
Australian Penaeus monodon by PCR analysis 
and DNA sequencing. Aquaculture 298, 190–193
Saksmerpromea V, Jitrakorna S., Chayaburakul K., 
Laiphromd S., Boonsuad K., Flegel T.W., 2011. 
Additional random, single to multiple genome 
fragments of Penaeus stylirostris densovirus in 
the giant tiger shrimp genome have implications 
for viral disease diagnosis. Virus Research 160, 
180–190.
Shike H., Dhar, A.K., Burns J.C., Shimizu C., Jousset 
F.X., Klimple K.R., Bergoin M., 2000. Infectious 
hypodermal and hematopoietic necrosis virus of 
shrimp is related to mosquito brevidensoviruses. 
Virology 277, 167–177.
Tang K.F.J. và Lightner D.V. 2006. Infectious 
hypodermal and hematopoietic necrosis virus 
(IHHNV) in the genome of the black tiger prawn 
Penaeus monodon from Africa and Australia. 
Virus Res; 118, 185–191.
Tang K.F.J., Navarro S.A. and Lightner D.V. 2007. A 
PCR assay for discriminating between infectious 
hypodermal and hematopoietic necrosis virus 
(IHHNV) and the virus-related sequences in the 
genome of Penaeus monodon. Dis. Aquat. Org; 
74, 165–170.
Tang K.F.J., Poulos B.T., Wang J., Redman R.M., 
Shih H.H. and Lightner D.V. 2003. Geographic 
variations among infectious hypodermal and 
hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates 
and characteristics of their infection. Dis. Aquat. 
Org; 53, 91–99.
Các website tham khảo:
book 1
117TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
DEVELOPMENT OF THE SPECIFIC PCR ASSAY FOR DETECTION OF 
INFECTIOUS HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC NECROSIS VIRUS 
(IHHNV), SPECIFIC INFECTED TYPE IN BLACK TIGER SHRIMP (Peneaus 
monodon) IN MEKONG DELTA
 Cao Thanh Trung1, Nguyen Thi Kim My2, Nguyen Viet Dung1
ABSTRACT
Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) is cause of mass mortality in 
blue shrimp Litopenaeus stylirostris and causes growth reduction and runt deformity syndrome 
(RDS) in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei and black tiger shrimp (Peneaus monodon). 
To detect virus, many methods have been used such as In situ hybridization, histopathology, trans-
mission electronic microcopy (TEM) and Polymerase chain reaction (PCR). PCR offers many ad-
vantages over other methods, including simple procedures and short detection time, and is specific. 
The specific pair of primers, IHHNVvn F2/IHHNVvn R1, were designed from a complete IHHNV 
genomic sequence (GenBank AF218266) and targeted the nucleotide positions 218–512 for which 
matching sequences have not been reported from inserted IHHNV type 3A/B. The PCR assay was 
highly specific for IHHNV and did not cross-react with other shrimp viruses including Hepatopan-
creatic Parvovirus (HPV), Monodon Baculovirus (MBV), White Spot Syndrome Virus (WSSV) 
and Vibrio infected shrimp. Detection limits of the IHHNV using the PCR assay was 4 copies of 
genomic IHHNV per PCR reaction and was the sensitive as conventional PCR (OIE) and IQ 2000 
PCR kit in detecting the viral pathogen from infected samples. These results considered that PCR 
is a simple and sensitive diagnostic technique that has potential application for routine detection of 
IHHNV infections in shrimp in the Mekong Delta.
Keywords: Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), Polymerase chain 
reaction (PCR), Mekong Delta.
Người phản biện: ThS. Ngô Thị Ngọc Thủy 
Ngày nhận bài: 12/9/2013 
Ngày thông qua phản biện: 25/9/2013 
Ngày duyệt đăng: 15/10/2013
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture 
 No2. 
 E-mail: thanhtrung77@yahoo.com 
2 University of Science Ho Chi Minh City