Phân lập và khảo sát đặc tính probiotic của các chủng Bacillus spp. từ môi trường ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng Tháp

olyticus) (B). 
78 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3: Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp sau 48 giờ
Thạch khuếch tán Vạch thẳng vuông góc
KH Nguồn gốc
E. 
icta-
luri
V. para-
haemo 
lyticus
V. 
har-
veyi
V. 
algino-
lyticus
E. 
icta-
luri
V. para-
haemo- 
lyticus
V. 
har-
veyi
V. 
algino-
lyticus
B7 Mẫu nước ao cá thịt +++ - - - - - - -
B14 Mẫu nước ao cá giống +++ - +++ - +++ - - -
B15 Mẫu nước ao cá giống - - +++ - - - - -
B27 Mẫu bùn ao cá thịt +++ - + - +++ - - + 
B30 Mẫu bùn ao cá thịt ++ - - - - - - -
B35 Mẫu bùn ao cá giống +++ - - - - - - -
B51 Hệ tiêu hóa cá thịt + + - - - - - -
B56 Hệ tiêu hóa cá thịt +++ - - - +++ - - -
B90 Hệ tiêu hóa cá giống - +++ - +++ +++ - - -
B97 Hệ tiêu hóa cá giống + - - +++ - - - + 
B98 Hệ tiêu hóa cá giống +++ +++ - - +++ - - - 
IV. THẢO LUẬN
Với những đặc điểm ưu việt như khả năng 
tạo bào tử, khả năng sinh enzyme ngoại bào 
và khả năng tiết ra các hợp chất kháng khuẩn, 
nhóm vi khuẩn Bacillus spp. được nghiên cứu 
nhiều nhất trong số các nhóm vi sinh vật có tiềm 
năng ứng dụng làm probiotic. Theo một nghiên 
cứu gần đây thực hiện bởi nhóm tác giả Nair và 
ctv. (2012) nhằm khảo sát sự đa dạng của quần 
xã vi sinh vật có đặc tính đối kháng từ các mẫu 
thu thập từ vùng cửa sông ở Cochin, dọc theo 
bờ biển tây nam Ấn Độ. Trong số 4.870 khuẩn 
lạc được sàng lọc, chỉ có khoảng 1% thể hiện 
đặc tính đối kháng mạnh đối với 6 chủng gây 
bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Vibrio harveyi, 
V. anguillarum, V. alginolyticus, V. vulnificus, 
V. parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila). 
Theo kết quả định danh bằng phương pháp 
sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA, các 
chủng đối kháng thuộc hai nhóm Bacillus và 
Pseudomonas, trong đó nhóm Bacillus chiếm 
đến 81%.
79TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Có khá nhiều nghiên cứu tiến hành phân lập 
các chủng Bacillus từ môi trường thủy sản hoặc 
với mục tiêu ứng dụng trong nuôi trồng thủy 
sản. Phương pháp sàng lọc chủ yếu được sử 
dụng là thử khả năng đối kháng với các chủng vi 
khuẩn gây bệnh cần quan tâm. Chủng Bacillus 
subtilis VSG1, phân lập từ hệ tiêu hóa của cá 
trôi Labeo rohita, có khả năng đối kháng rất 
mạnh với 6 chủng Aeromonas hydrophila gây 
bệnh trên cá, với khoảng cách vùng đối kháng 
19-21 mm theo phương pháp thạch khuếch tán 
(Giri và ctv., 2011). Tương tự, chủng B. cereus 
TC-2 phân lập từ chất thải phụ phẩm trái dừa, 
thể hiện hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh (theo 
phương pháp vạch thẳng vuông góc) đối với 
V. harveyi (khoảng cách vùng đối kháng 13 
mm) và V. parahaemolyticus (khoảng cách 
vùng đối kháng 12 mm) (Nair và ctv., 2011). 
Theo Yilmaz và ctv. (2006), B. cereus có khả 
năng tiết ra các chất kháng sinh như cerexin và 
zwittermicin, điều này giải thích cho hoạt tính 
kháng khuẩn mạnh ở loài vi khuẩn này. Luis-
Villasenor và ctv. (2011) nghiên cứu đặc tính 
đối kháng với nhóm Vibrio gây bệnh bởi 4 
chủng Bacillus sp. phân lập từ hệ tiêu hóa của 
tôm chân trắng, bằng phương pháp đổ thạch 
lớp kép và phương pháp thạch khuếch tán. Kết 
quả của phương pháp thạch lớp kép cho thấy 
chỉ có hai chủng (YC5-2 và YC2-a) ức chế sự 
phát triển của V. campbellii và V. vulnificus, với 
khoảng cách vòng đối kháng từ 5-18 mm. Kết 
quả của phương pháp thạch khuếch tán cho thấy 
có 4 chủng (YC5-2, YC2-a, YC3-b và C2-2) ức 
chế sự tăng trưởng của V. parahaemolyticus và 
V. harveyi, với khoảng cách vòng đối kháng từ 
11-17,5 mm. Cả 4 chủng khảo sát đều không 
thể hiện sự ức chế đối với V.alginolyticus. Mới 
đây, Jayaseelan và ctv. (2013) khảo sát hoạt 
tính đối kháng với nhóm Vibrio của 7 chủng 
probiotic B. licheniformis được phân lập từ ao 
nuôi tôm. Kết quả cho thấy trong số 7 chủng 
khảo sát chủng Dahb1 cho vùng đối kháng 
mạnh nhất (6-12 mm, phương pháp vạch thẳng 
vuông góc) đối với 162 chủng Vibrio spp. phân 
lập từ trại giống và ao nuôi tôm sú, bao gồm V. 
harveyi (53 chủng), V. anguillarum (42 chủng), 
V. vulnificus (31 chủng) và V. damselae (36 
chủng). Điều đáng lưu ý là kết quả khoảng cách 
vùng đối kháng trong nghiên cứu của các nhóm 
tác giả Nair và ctv. (2011), Luis-Villasenor và 
ctv. (2011) và Jayaseelan và ctv. (2013) là tương 
tự với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Còn 
khoảng cách vùng đối kháng trong nghiên cứu 
của nhóm tác giả Giri và ctv. (2011) là cao hơn 
nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi.
Các nghiên cứu của một số nhóm tác giả đã 
khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của 
nhóm vi khuẩn Bacillus spp. cũng như khả năng 
kích thích vật chủ tiết ra các enzyme tiêu hóa. 
Wang (2007) và Nejad và ctv. (2006) đã chứng 
minh khi bổ sung một lượng vi khuẩn Bacillus 
vào thức ăn nuôi tôm thì hoạt tính các enzyme 
tiêu hóa lipase, cellulase, protease và amylase 
của tôm đều tăng có khác biệt về mặt thống kê 
so với nghiệm thức đối chứng. Các tác giả này 
cũng cho rằng chính sự hiện diện của Bacillus 
đã kích thích vật chủ sản xuất ra một lượng lớn 
enzyme ngoại bào. Ngoài ra, nghiên cứu của 
Ghosh và ctv. (2002) cho thấy Bacillus pumilus 
có khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào bao 
gồm amylase và cellulase, là những enzyme 
quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột. 
Với khả năng tiết ra các enzyme tiêu hóa ngoại 
bào nói trên, nhóm Bacillus spp. có thể được sử 
dụng thông qua con đường bổ sung vào thức ăn 
để đưa vào hệ tiêu hóa của vật chủ, tại đó chúng 
có thể thể hiện các đặc tính probiotic của mình, 
cụ thể là hỗ trợ cho hệ tiêu hóa và nâng cao sức 
tăng trưởng của vật chủ.
80 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
V. KẾT LUẬN
1. Từ 52 mẫu thu thập từ hệ tiêu hóa cá 
tra, nước và bùn ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng 
Tháp trong năm 2013, chúng tôi chọn lọc ban 
đầu được 76 chủng với những đặc điểm hình 
thái tiêu biểu cho nhóm Bacillus: Gram dương, 
hình que, sinh nội bào tử và phản ứng catalase 
dương tính.
2. Kết quả phân lập dựa vào khả năng sinh 
enzyme ngoại bào cho thấy có 46 chủng có khả 
năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên. Trong đó có 
23 chủng sinh 4 enzyme, chiếm 50% trên tổng 
số chủng vi khuẩn khảo sát.
3. Kết quả phân lập dựa vào khả năng đối 
kháng với vi khuẩn gây bệnh bằng phương 
pháp thạch khuếch tán và phương pháp vạch 
thẳng vuông góc, chúng tôi sàng lọc được 11 
chủng có khả năng đối kháng với ít nhất 1 
trong 4 chủng vi khuẩn gây bệnh (Edwardsiella 
ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, 
V. alginolyticus). 11 chủng Bacillus spp. được 
tuyển chọn có tiềm năng được sử dụng làm 
probiotic trong nuôi trồng thủy sản. 
LỜI CÁM ƠN
Tác giả chân thành cảm ơn các bạn cộng 
tác viên của đề tài và các bạn đồng nghiệp của 
Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên 
cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 đã hỗ trợ cho 
nghiên cứu thành công.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Avella, M.A., Gioacchini, G., Decamp, O., Makridis, 
P., Bracciatelli, C., Carnevali, O., 2010. 
Application of multi-species of Bacillus in sea 
bream larviculture. Aquaculture 305, 12-19.
Cha, J.-H., Rahimnejad, S., Yang, S.-Y., Kim, K.-W., 
Lee, K.-J., 2013. Evaluations of Bacillus spp. as 
dietary additives on growth performance, innate 
immunity and disease resistance of olive flounder 
(Paralichthys olivaceus) against Streptococcus 
iniae and as water additives. Aquaculture 402-
403, 50-57.
Daniels, C.L., Merrifield, D.L., Boothroyd, D.P., Davies, 
S.J., Factor, J.R., Arnold, K.E., 2010. Effect of 
dietary Bacillus spp. and mannan oligosaccharides 
(MOS) on European lobster (Homarus gammarus 
L.) larvae growth performance, gut morphology 
and gut microbiota. Aquaculture 304, 49-57.
Dias, D.R., Vilela, D.M., Silvestre, M.P.C., Schwan, 
R.F., 2008. Alkaline protease from Bacillus sp. 
isolated from coffee bean grown on cheese whey. 
World J. Microbiol. Biotechnol. 24, 2027-2034. 
Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques, 
A.O., Cutting, S.M., 2004. Characterization of 
Bacillus probiotics available for human use. Appl. 
Environ. Microbiol. 70, 2161-2171.
Gatesoupe, F.J., 1999. The use of probiotics in 
aquaculture. Aquaculture 180, 147-165.
Ghosh, K., Sen, S.K., Ray, A.K., 2002. Characterization 
of Bacilli isolated from gut of rohu, Labeo rohita, 
fingerlings and its significance in digestion. J. 
Appl. Aquaculture 12(3), 33-42.
Giri, S.S., Sukumaran, V., Sen, S.S., Vinumonia, 
J., Banu, B.N., Jena, P.K., 2011. Antagonistic 
activity of cellular components of potential 
probiotic bacteria, isolated from the gut of Labeo 
rohita, against Aeromonas hydrophila. Probiotics 
& Antimicro. Prot. 3, 214-222.
Haddar, A., Hmidet, N., Ghorbel-Bellaaj, O., Fakhfakh-
Zouari, N., Sellami-Kamoun, A., Nasri, M., 
2011. Alkaline proteases produced by Bacillus 
licheniformis RP1 grown on shrimp wastes: 
Application in chitin extraction, chicken feather-
degradation and as a dehairing agent. Biotechnol. 
Bioprocess Engineer. 16, 669-678.
Hong, H.A., Duc, L.H., Cutting, S.M., 2005. The use 
of bacterial spore formers as probiotics. FEMS 
Microbiol. Rev. 29, 813-835.
Jayaseelan, B.D., Vaseeharan, B., Maharajan, A., 
Shanthi, S., Vinoj, G., 2013. Vibriostatic effects 
of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 and its 
81TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
molecular phylogeny resolved through RAPD 
markers. Ann. Microbiol., DOI 10.1007/s13213-
013-0623-z. 
Lee, K.H., Jun, K.D., Kim, W.S., Paik, H.D., 2001. 
Partial characterization of polyfermenticin 
SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus 
polyfermenticus. Lett. Appl. Microbiol. 32, 146-
151.
Liu, K.-F., Chiu, C.-H., Shiu, Y.-L., Cheng, W., Liu, 
C.-H., 2010. Effects of the probiotic, Bacillus 
subtilis E20, on the survival, development, stress 
tolerance, and immune status of white shrimp, 
Litopenaeus vannamei larvae. Fish & Shellfish 
Immunol. 28, 837-844. 
Luis-Villasenor, I.E., Macías-Rodríguez, M.E., Gómez-
Gil, B, Ascencio-Valle, F., Campa-Córdova, A.I., 
2011. Beneficial effects of four Bacillus strains on 
the larval cultivation of Litopenaeus vannamei. 
Aquaculture 321, 136-144.
Nagal, S., Okimura, K., Kaizawa, N., Ohki, K., 
Kanatomo, S., 1996. Study on surfactin, a cyclic 
depsipeptide. II. Synthesis of surfactin B2 
produced by Bacillus natto KMD 2311. Chem. 
Phar. Bull. Tokyo 44, 5-10.
Nair, A.G.H., Donio, M.T.B.S., Viji, V.R.T., 
Michaelbabu, M., Citarasu, T., 2011. Isolation 
from coconut retting effluent of Bacillus cereus 
TC-2 antagonistic to pathogenic Vibrios. Ann. 
Microbiol. 61, 631-637.
Nair, A.V., Vijayan, K.K., Chakraborty, K., Antony, 
M.L., 2012. Diversity and characterization of 
antagonistic bacteria from tropical estuarine 
habitats of Cochin, India for fish health 
management. World J. Microbiol. Biotechnol. 28, 
2581-2592.
Nejad, S.Z., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L., 
Mirvaghefi, A.R., Shakouri, M., 2006. The effect 
of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on 
digestive enzyme activity, survival and growth in 
the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. 
Aquaculture 252, 516-524.
Nimrat, S., Suksawat, S., Boonthai, T., Vuthiphandchai, 
V., 2012. Potential Bacillus probiotics enhance 
bacterial numbers, water quality and growth during 
early development of white shrimp (Litopenaeus 
vannamei). Vet. Microbiol. 159, 443-450.
Sharmila, R., Jawahar Abraham, T., Sundararaj, V., 
1996. Bacterial flora of semi-intensive pond 
reared Penaeus indicus and the environment. J. 
Aquaculture Tropics 11, 193-203.
Sun, Y.-Z., Yang, H.-L., Huang, K.-P., Ye, J.-D., 
Zhang, C.-X., 2013. Application of autochthonous 
Bacillus bioencapsulated in copepod to grouper 
Epinephelus coioides larvae. Aquaculture 392-
395, 44-50.
Urdaci, M.C., Pinchuk, I., 2004. Antimicrobial activity 
of Bacillus probiotics. In: Bacterial spore formers: 
probiotics and emerging applications (Ricca, E., 
Henriques, A.O. and Cutting, S.M., Eds.), pp. 
171-182. Horizon Bioscience.
Vaseeharan, B., Ramasamy, P., 2003. Control of 
pathogenic Vibrio sp. by Bacillus subtilis BT23, a 
possible probiotic treatment for black tiger shrimp 
Penaeus monodon. Lett. Appl. Microbiol. 36, 83-87.
Wang, Y.B., 2007. Effect of probiotics on growth 
performance and digestive enzyme activity of the 
shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture 269, 259-
264.
Yilmaz, M., Soran, H., Beyatli, Y., 2006. Antimicrobial 
activities of some Bacillus sp. strains isolated 
from the soil. Microbiol. Res. 161, 127-131.
Zokaeifar, H., Balcázar, J.L., Saad, C.R., Kamarudin, 
M.S., Sijam, K., Arshad, A., Nejat, N., 2012. 
Effects of Bacillus subtilis on the growth 
performance, digestive enzymes, immune gene 
expression and disease resistance of white shrimp, 
Litopenaeus vannamei. Fish & Shellfish Immunol. 
33, 683-689.
82 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ISOLATION AND EVALUATION OF PROBIOTIC PROPERTIES OF Bacillus 
spp. FROM STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) POND 
ENVIRONMENT IN DONG THAP PROVINCE
Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Van Thi Thuy1, Nguyen Van Chac2
ABSTRACT
This study was conducted since June to August 2013, at the Department of Experimental Biology, Research 
Institute for Aquaculture No2. The material for isolation (40 samples from striped catfish’s gut, 6 water 
samples and 6 sediment sample from the nursing and grow-out striped catfish’s ponds) was collected from 
Thanh Binh district and Hong Ngu district, Dong Thap province. The screening process for probiotic Bacillus 
bacteria was undertaken in 3 steps. Step 1 which was based on morphological screening (Gram-positive, rod 
shape and the presence of endospores) combined with catalase reaction, resulted in 76 isolates. Step 2 which 
was based on the ability to excrete exogenous enzymes (protease, amylase, lipase, cellulase), resulted in 46 
isolates excreting at least 3 enzymes. Step 3 was based on the antagonistic ability toward the aquatic patho-
gens (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus) and resulted in 11 isolates 
which antagonized at least one pathogenic strain. These 11 isolates are being preserved in the culture collec-
tion of the Department of Experimental Biology and have potential to be used as probiotics in aquaculture.
Keywords: antagonistic ability; Bacillus; exogenous enzymes; probiotic; striped catfish. 
Người phản biện: TS. Đặng Tố Vân Cầm 
Ngày nhận bài: 12/9/2013 
Ngày thông qua phản biện: 20/9/2013 
Ngày duyệt đăng: 15/10/2013
1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. 
 Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn 
2 Nong Lam University, Ho Chi Minh City