Khả năng phân hủy quorum sensing của một số chủng vi sinh vật phân lập từ môi trường ao nuôi tôm

ính toán thể tích 
52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
dịch khuẩn cần thiết bổ sung vào các ống falcon 
chứa 10 ml môi trường NB hoặc môi trường 
MRS để đạt được mật độ 106 (CFU/ml). Bố 
trí 3 ống falcon cho mỗi chủng vi khuẩn khảo 
sát. Sau đó bổ sung dung dịch HHL stock vào 
các ống falcon trên để đạt nồng độ là 5 ppm. 
Nghiệm thức đối chứng bao gồm 3 ống falcon 
chỉ chứa môi trường NB và 5 ppm dung dịch 
HHL mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả các 
ống falcon được đặt trong tủ ấm lắc ở 30oC (đối 
với các chủng Bacillus) hoặc 37oC (đối với các 
chủng LAB), tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 6 
giờ. Thời gian 6 giờ là khoảng thời gian thích 
hợp tại đó đa số hoạt động phân hủy quorum 
sensing (nếu có) xảy ra, khoảng thời gian này 
được xác định trong các thí nghiệm thăm dò 
trước đây. Ngoài ra còn bố trí một nghiệm thức 
“blank”, gồm ống falcon chứa môi trường NB 
(hoặc MRS) và HHL ở nồng độ 5 ppm, được 
chuẩn bị tại thời điểm sau 6 giờ. Mục đích của 
nghiệm thức blank là để đánh giá mức độ phân 
hủy hóa học (phân hủy tự nhiên) của phân tử 
HHL trong môi trường NB. Theo Yates và ctv., 
(2002), phân tử AHL có thể bị phân hủy hóa học 
ở một số điều kiện nhất định như pH > 6,5, nhiệt 
độ > 30oC.
Sau thời gian ủ, hút 1ml từ mỗi ống falcon 
(kể cả các ống đối chứng và blank) cho vào các 
eppendorf tương ứng, ly tâm ở 10.000 rpm trong 
10 phút. Sau khi ly tâm, hút 10 µl của dịch nổi 
từ mỗi eppendorf nhỏ lên đĩa NA tương ứng đã 
được tráng sẵn bởi 100 µl dịch khuẩn CV026. 
Sau thời gian ủ ở 30oC trong 24 giờ, đo đường 
kính các vòng tròn violacein màu tím (nếu có) 
xuất hiện trên đĩa. Từ phương trình tương quan 
tuyến tính đã xây dựng, xác định nồng độ HHL 
còn lại trong môi trường. 
Xác định tốc độ phân hủy HHL (mg/l/giờ) 
theo công thức: R = ([HHL]
ĐC 
– [HHL]NT) / t
Trong đó, [HHL]
ĐC
: nồng độ HHL còn lại 
trong môi trường ở nghiệm thức đối chứng;
 [HHL]NT: nồng độ HHL còn lại trong môi 
trường ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn;
 t: thời gian khảo sát (6 giờ).
Đánh giá mức độ phân hủy phân tử HHL 
theo 3 mức như sau:
Bảng 2. Đánh giá mức độ phân hủy phân tử HHL
Nồng độ HHL còn lại trong 
môi trường
Tốc độ phân hủy (mg/l/giờ) Mức độ phân hủy
[HHL] < 0,5 mg/l
0,5 mg/l ≤ [HHL] < 2,0 mg/l
2,0 mg/l ≤ [HHL] < 4,0 mg/l
[HHL] ≥ 4,0 mg/l
R ≥ 0,70 mg/l/giờ
0,47 mg/l/giờ ≤ R < 0,70 mg/l/giờ
0,14 mg/l/giờ ≤ R < 0,47 mg/l/giờ
R < 0,14 mg/l/giờ
Phân hủy mạnh
Phân hủy trung bình
Phân hủy yếu
Không phân hủy
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả xác định phương trình tương 
quan tuyến tính giữa ln[HHL] trong môi trường 
và đường kính vòng tròn sắc tố violacein
Phương trình tương quan tuyến tính có 
dạng như sau: y = 0,7978x + 1,745, với hệ số 
tương quan R2 = 0,9918.
3.2. Kết quả khảo sát khả năng phân 
hủy phân tử HHL bởi các chủng vi khuẩn 
tuyển chọn
Dựa vào phương trình tương quan tuyến 
tính đã xây dựng, kết quả khảo sát nồng độ HHL 
còn lại trong môi trường sau 6 giờ và tốc độ 
phân hủy HHL bởi các chủng vi khuẩn tuyển 
chọn được trình bày trong Bảng 3.
53TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3. Nồng độ HHL còn lại trong môi trường (mg/l) và tốc độ phân hủy HHL (mg/l/giờ) bởi 
các chủng vi khuẩn khảo sát. Giá trị trung bình của 3 lần lập lại.
Nghiệm thức
Đường kính 
(cm)
[HHL]
Tốc độ phân 
hủy (mg/l/giờ)
Ghi chú
Nhóm Bacillus
Blank 3,03 5,0
Đối chứng 3,0 4,81 0,03 Có phân hủy hóa học
B1.1 0,0 0,11 0,78 Phân hủy mạnh
B6.1 2,68 3,25 0,26 Phân hủy yếu
B17.1 2,73 3,46 0,23 Phân hủy yếu
B24.1 2,78 3,67 0,19 Phân hủy yếu
B1.2 0,0 0,11 0,78 Phân hủy mạnh
B3.2 2,73 3,46 0,23 Phân hủy yếu
B8.2 0,0 0,11 0,78 Phân hủy mạnh
B20.2 2,82 3,82 0,17 Phân hủy yếu
B21.2 2,10 1,55 0,54 Phân hủy trung bình
Nhóm vi khuẩn LAB
Blank 3,02 4,90
Đối chứng 3,0 4,81 0,02 Có phân hủy hóa học
LA10.1 1,42 0,66 0,69 Phân hủy trung bình
LA12.1 2,63 3,03 0,30 Phân hủy yếu
LA15.1 0,0 0,11 0,78 Phân hủy mạnh
LA17.1 1,50 0,73 0,68 Phân hủy trung bình
LA30.2 1,75 1,01 0,63 Phân hủy trung bình
Từ kết quả ở Bảng 3, Hình 1 và Hình 2 
cho thấy sau thời gian khảo sát 6 giờ, đối với 
nhóm Bacillus có 3 chủng phân hủy mạnh (tốc 
độ phân hủy 0,78 mg/l/giờ), 1 chủng phân hủy 
trung bình (tốc độ phân hủy 0,54 mg/l/giờ) và 5 
chủng phân hủy yếu (tốc độ phân hủy 0,17-0,26 
mg/l/giờ) đối với phân tử HHL. Đối với nhóm 
vi khuẩn LAB có 1 chủng phân hủy mạnh (tốc 
độ phân hủy 0,78 mg/l/giờ), 1 chủng phân hủy 
yếu (tốc độ phân hủy 0,30 mg/l/giờ) và 3 chủng 
phân hủy trung bình (tốc độ phân hủy 0,63-0,69 
mg/l/giờ) đối với HHL. Có hiện tượng phân hủy 
hóa học đối với phân tử HHL xảy ra ở nghiệm 
thức đối chứng, tuy nhiên với tốc độ không đáng 
kể (0,02-0,03 mg/l/giờ).
54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 1. Tốc độ phân hủy HHL của các chủng Bacillus sau thời gian 6 giờ nuôi cấy trong môi 
trường NB có chứa 5 ppm phân tử HHL.
Hình 2. Tốc độ phân hủy HHL của các chủng LAB sau thời gian 6 giờ nuôi cấy trong môi trường 
MRS có chứa 5 ppm phân tử HHL.
55TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN
Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng 
ức chế độc lực của vi khuẩn gây bệnh thông qua 
khả năng phân hủy quorum sensing, đã trở thành 
một cách tiếp cận mới trong vòng hai thập kỷ 
gần đây. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo 
sát khả năng phân hủy quorum sensing của một 
số chủng vi khuẩn thuộc hai nhóm Bacillus và 
nhóm LAB, các chủng này trước đó đã được 
khảo sát một số đặc tính probiotic khác như khả 
năng sinh enzyme ngoại bào và khả năng đối 
kháng với nhóm Vibrio gây bệnh. Hai nhóm 
Bacillus và nhóm LAB thường được sử dụng 
phổ biến trong thành phần các chế phẩm vi sinh, 
do chúng có một số ưu điểm như khả năng tạo 
bào tử chịu được nhiệt độ cao trong quá trình 
phối trộn sản phẩm, hoặc khả năng tồn tại ở điều 
kiện pH thấp trong ống tiêu hóa của vật chủ.
Phân tử HHL được chọn làm nguồn vật liệu 
để khảo sát, vì đây là loại phân tử tín hiệu quorum 
sensing hiện diện ở khá nhiều loài vi khuẩn gây 
bệnh trong nuôi trồng thủy sản, như Aeromonas 
hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio 
alginolyticus, Vibrio salmonicida, Edwardsiella 
tarda (Defoirdt et al., 2004). Phân tử HHL cũng 
là loại phân tử tín hiệu được nhận biết bởi chủng 
Chromobacterium violaceum CV026, và kích 
thích sự tiết sắc tố violacein gây phản ứng tạo 
màu ở chủng vi khuẩn này. Chủng CV026 được 
sử dụng rất phổ biến như là chủng chỉ thị cho sự 
hiện diện của các phân tử AHL ngoại lai trong 
môi trường cũng như đánh giá khả năng phân 
hủy AHL bởi vi khuẩn hay bởi các enzyme. 
Khoảng thời gian phù hợp nhất để khảo sát 
tốc độ phân hủy phân tử AHL là trong vòng 6 
giờ sau khi AHL được bổ sung vào trong môi 
trường, theo kết quả nghiên cứu của các nhóm 
tác giả khác.
Có hai nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo 
sát khả năng phân hủy phân tử HHL bởi các 
chủng Bacillus phân lập từ các nguồn gốc khác 
nhau. Các chủng Bacillus trong nghiên cứu của 
Defoirdt và ctv., (2011) được phân lập từ các 
hỗn hợp làm giàu EC5-Tinh, phân lập từ hệ 
tiêu hóa tôm thẻ chân trắng và EC5-Cam, phân 
lập từ hệ tiêu hóa cá chẽm châu Âu. Năm trong 
số 27 chủng cho kết quả phân hủy tốt nhất đối 
với phân tử HHL (các chủng này thuộc hai 
loài B. anthracis và B. subtilis). Tốc độ phân 
hủy HHL của đa số các chủng này đạt 0,7-0,8 
mg/l/giờ sau 6 giờ khảo sát, tương đương với 
kết quả nghiên cứu của chúng tôi, riêng chủng 
LT12 đạt 0,9 mg/l/giờ. Mười chủng Bacillus 
trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 
và ctv., (2013) được phân lập từ nước và bùn 
ao nuôi cá Tra. Các chủng này có khả năng 
phân hủy HHL ở mức phân hủy trung bình (tốc 
độ phân hủy 0,66-0,71 mg/l/giờ) đến phân hủy 
mạnh (tốc độ phân hủy 0,78 mg/l/giờ). Nhóm 
Bacillus ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn 
về khả năng phân hủy các phân tử AHL có liên 
quan đến độc lực của vi khuẩn gây bệnh, do 
nhiều loài Bacillus sp. đã được chứng minh là 
có mang gen aiiA mã hóa cho enzyme AHL-
lactonase, là một trong ba loại enzyme xúc tác 
phản ứng bẽ gãy phân tử AHL. Tuy nhiên đối 
với nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, hiện nay 
chưa có nghiên cứu nào liên quan đến sự hiện 
diện của gen mã hóa enzyme phân hủy AHL ở 
nhóm vi khuẩn này.
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Tất cả 14 chủng vi khuẩn khảo sát đều thể 
hiện khả năng phân hủy đối với phân tử HHL, 
trong đó có 4 chủng phân hủy mạnh, 4 chủng 
phân hủy trung bình và 6 chủng phân hủy yếu.
- Các chủng phân hủy HHL mạnh (B1.1, 
B1.2, B8.2 và LA15.1) kết hợp với những đặc 
tính probiotic khác của chúng (khả năng sinh 
enzyme ngoại bào, đối kháng với vi sinh vật gây 
bệnh), có thể được đưa vào trong thành phần 
chế phẩm vi sinh để sử dụng trong nuôi trồng 
thủy sản.
56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
- Cần tiếp tục sàng lọc những chủng 
vi khuẩn có khả năng phân hủy các phân tử 
AHL có liên quan đến độc lực ở các loài vi 
khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy sản 
(thuộc nhóm Vibrio spp., Pseudomonas spp., 
Edwardsiella spp). 
LỜI CÁM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí bởi 
chương trình công nghệ sinh học nông nghiệp 
thủy sản, Hợp đồng nghiên cứu khoa học và 
phát triển số 614a / HĐ-KHCN-CNSH. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bassler, B.L., Wright, M., Showalter, R.E., Silverman, 
M.R., 1993. Intercellular signalling in Vibrio 
harveyi: sequence and function of genes regulating 
expression of luminescence. Mol Microbiol, 9, p. 
773-786.
Bassler, B.L., Wright, M., Silverman, M.R., 1994. 
Multiple signalling systems controlling expression 
of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and 
function of genes encoding a second sensory 
pathway. Mol Microbiol, 13, p. 273-286.
Cam, D.T.V., Nhan, D.T., Ceuppens, S., Hao, N.V., 
Dierckens, K., Wille, M., Sorgeloos, P., Bossier, 
P., 2009. Effect of N-acyl homoserine lactone-
degrading enrichment cultures on Macrobrachium 
rosenbergii larviculture. Aquaculture, 294, p. 
5-13.
Defoirdt, T., Boon, N., Bossier, P., Verstraete, W., 
2004. Disruption of bacterial quorum sensing: 
an unexplored strategy to fight infections in 
aquaculture. Aquaculture, 240, p. 69-88.
Defoirdt, T., Loan, D.T., Van Delsen, B., De Schryver, 
P., Sorgeloos, P., Boon, N., Bossier, P., 2011. 
N-acylhomoserine lactone-degrading Bacillus 
strains isolated from aquaculture animals. 
Aquaculture, 311(1-4), p. 258-260.
Defoirdt, T., Verstraete, W., Bossier, P., 2008. 
Luminescence, virulence and quorum sensing 
signal production by pathogenic Vibrio campbellii 
and Vibrio harveyi isolates. J Appl Microbiol, 
104, p. 1480-1487.
Henke, J.M., Bassler, B.L., 2004. Three parallel 
quorum-sensing systems regulate gene expression 
in Vibrio harveyi. J Bacteriol, 186, p. 6902-6914.
Lilley, B.N., Bassler, B.L., 2000. Regulation of quorum 
sensing in Vibrio harveyi by LuxO and Sigma-54. 
Mol Microbiol, 36, p. 940-954.
Manefield, M., Harris, L., Rice, S.A., de Nys, R., 
Kjelleberg, S., 2000. Inhibition of luminescence 
and virulence in the black tiger prawn (Penaeus 
monodon) pathogen Vibrio harveyi by intercellular 
signal antagonists. Appl Environ Microbiol, 66, p. 
2079-2084.
McClean, K.H., Winson, M.K., Fish, L. et al., 1997. 
Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: 
exploitation of violacein production and inhibition 
for the detection of N-acylhomoserine lactones. 
Microbiology, 143, p. 3703-3711.
Mok, K.C., Wingreen, N., Bassler, B.L., 2003. Vibrio 
harveyi quorum sensing: a coincidence detector 
for two autoinducers controls gene expression. 
EMBO J, 22, p. 870-881.
Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Nguyễn Viết Dũng, Văn Thị 
Thúy, Nguyễn Thảo Sương, 2013. Nghiên cứu 
tạo enzyme AHL-lactonase tái tổ hợp có khả năng 
phân hủy phân tử tín hiệu liên quan đến độc lực ở 
một số loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy 
sản. Báo cáo khoa học tổng kết đề tài, 65 trang.
Schauder, S., Bassler, B.L., 2001. The languages of 
bacteria. Genes & Development, 15, p. 1468-
1480.
Tinh, N.T.N., Yen, V.H.N., Dierckens, K., Sorgeloos, 
P., Bossier, P., 2008. An acyl homoserine lactone-
degrading microbial community improves 
the survival of first-feeding turbot larvae 
(Scophthalmus maximus L.). Aquaculture, 285, p. 
56-62.
Yang, Q., Han, Y., Tinh, N.T.N., Hien, N.T., Bossier, 
P., 2012. Detection of quorum sensing signal 
molecules in Edwardsiella ictaluri Ei-151. Indian 
J Microbiol, 52(4), p. 581-586. 
Yates, E.A., Philipp, B., Buckley, C., Atkinson, S., 
Chhabra, S.R., Sockett, R.E., Goldner, M., 
Dessaux, Y., Camara, M., Smith, H., Williams, 
P., 2002. N-acylhomoserine lactones undergo 
lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl 
chain length-dependent manner during growth of 
Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas 
aeruginosa. Infect & Immunol, 70(10), p. 5635-
5646.
57TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
QUORUM SENSING-DEGRADING ABILITY OF MICROBIAL ISOLATES
 FROM SHRIMP POND ENVIRONMENT
Nguyen Thi Ngoc Tinh1*, Nguyen Thao Suong1, Nguyen Dinh Song Troi2 
ABSTRACT
Quorum sensing is a cell-to-cell communication process in bacterial kingdom, with the production 
and detection of “signal molecules” in a population density-dependent manner. Quorum sensing 
system has been shown to control virulence factors in several Gram-negative bacterial pathogens 
in aquaculture, including Vibrio harveyi and Edwardsiella ictaluri, pathogenic bacteria in shrimp 
and catfish, respectively. It has been shown that the ability to inactivate AHL (N-acyl homoserine 
lactone) signal molecules may be useful in controlling the AHL-mediated virulence in many 
Gram-negative pathogenic bacteria. In this study, we evaluated the ability to degrade N-hexanoyl 
homoserine lactone (HHL molecule) by 14 isolates, including 9 isolates from Bacillus group and 
5 isolates from lactic acid bacteria (LAB) group, which were isolated from shrimp gut and from 
shrimp pond environment in Ca Mau province. After 6-hour experiment, 4 isolates (3 Bacillus 
isolate and 1 LAB isolate) showed strong degradation ability toward HHL molecule (degradation 
rate 0.78 mg/l/h). The results of our study are important findings for the application of AHL-
degrading bacteria in biocontrol of pathogens in aquaculture which virulence is related to the AHL-
mediated quorum sensing system.
Keywords: Bacillus, Chromobacterium violaceum, HHL, quorum sensing, degradation rate.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015
1. Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. 
* Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn 
2. Open University, Hochiminh City