Khả năng kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri của hai chủng Bacillus subtilis Q16 và Bacillus subtilis Q111 trong điều kiện cảm nhiễm trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống

OD610 và mật 
độ tế bào vi khuẩn E. ictaluri và (Trần Linh 
Thước, 2010). Ngâm vi khuẩn E. ictaluri (mật 
độ thử nghiệm 108, 109, 1010, 1011 CFU.ml-1) 
trong 15 l nước.10 con cá-1.lô-1. Sau 60 phút, 
bơm nước để đạt 40 l (Capkin và ctv., 2009). 
Cá thử nghiệm nhịn đói trong 12 giờ sau khi 
cảm nhiễm. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 
lần. Ghi nhận số cá chết hằng ngày cho đến khi 
cá ngưng chết liên tục trong 3 ngày (Newaj-
Fyzul và ctv., 2007). 
LD
50
 được tính dựa vào công thức của 
Reed và Muech (1938): LD
50
 = 10 (lũy thừa của nồng 
độ gây chết nhỏ nhất nhưng trên 50% - PD). Trong đó, PD = [(tỉ 
lệ cá nhiễm thấp nhất nhưng trên 50% - 50%) 
(tỉ lệ cá nhiễm thấp nhất nhưng trên 50% - tỉ lệ 
cá nhiễm cao nhất nhưng dưới 50%)-1].
LD50 được tính dựa vào công thức của 
Reed và Muech (1938): LD
50
 = 10 (lũy thừa của nồng 
độ gây chết nhỏ nhất nhưng trên 50% - PD). Trong đó, PD = [(tỉ 
lệ cá nhiễm thấp nhất nhưng trên 50 - 50%)×(tỉ 
lệ cá nhiễm thấp nhất nhưng trên 50% - tỉ lệ cá 
nhiễm cao nhất nhưng dưới 50%)-1]. 
2.2.5. Đánh giá khả năng bảo vệ cá tra giống 
trong điều kiện gây nhiễm E. ictaluri của hai 
chủng vi khuẩn B. subtilis (Q16, Q111)
Các lô thí nghiệm và thức ăn được chuẩn 
bị tương tự mục thí nghiệm đánh giá tính an 
toàn của 2 chủng thử nghiệm lên cá tra giống, 
trong đó bột đông khô được thay bằng chế 
phẩm thử nghiệm.
Thí nghiệm được tiến hành ở 5 nghiệm 
thức: 2 nghiệm thức đơn chủng, 1 nghiệm 
thức phối hợp chủng, đối chứng dương và đối 
chứng âm. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 
Ở nghiệm thức thử nghiệm, thức ăn được bổ 
sung vi khuẩn tương ứng với liều lượng: 3% 
trọng lượng cá×lần-1, 2 lần×ngày-1 (Essa và 
ctv., 2010). Sau 28 ngày, các nghiệm thức thử 
nghiệm và đối chứng dương được cảm nhiễm 
với E. ictaluri mật độ 2. LD
50
 (Newaj-Fyzul, 
2007). Bể đối chứng âm bổ sung môi trường 
canh BHI.
Theo dõi và ghi nhận số cá chết trong 
14 ngày cho ăn thức ăn bổ sung vi khuẩn 
thử nghiệm. Tỉ lệ sống của cá được tính theo 
công thức: % sống = số cá sống.tổng số cá 
thí nghiệm-1. Xác định chỉ số RPS (Relative 
Percentage of Survival) theo công thức: RPS = 
(1- (số cá chết ở nghiệm thức vừa có probiotic 
vừa có E. ictaluri/số cá chết ở nghiệm thức 
không bổ sung vi khuẩn (đối chứng âm)-1) x 
100 (Amend, 1981).
Kết quả được xử lý thống kê ANOVA 
của phần mềm Excel của Microsoft và phần 
mềm Stargraphic 3.0. Kết quả trình bày gồm 
giá trị trung bình sai số.
Cá chết sau khi được kiểm tra dấu hiệu 
bệnh lý, đồng thời tiến hành phân lập định 
danh vi khuẩn trong gan, thận, lách của cá 
bằng các thử nghiệm sinh hoá theo khoá phân 
loại Bergey’s (Holt và ctv., 1994).
III.	KẾT	QUẢ
3.1.	Khả	năng	đối	kháng	E. ictaluri	của	các	
chủng	B. subtilis	(Q16,	Q111)
Hai chủng vi khuẩn B. subtilis Q16 và B. 
subtilis Q111 được thử khả năng đối kháng với 
E. ictaluri gây bệnh trên cá tra. Bằng phương 
pháp cấy vạch vuông góc, tại các vị trí giao 
nhau ở 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, chủng E. 
ictaluri đều không mọc. Điều này cho thấy, 
cả 2 chủng thử nghiệm đều đối kháng với E. 
ictaluri (Hình 1). Bằng phương pháp giếng 
khuếch tán, 2 chủng B. subtilis Q16 và Q111 
±
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 51
3.3.	Sản	xuất	thử	nghiệm	chế	phẩm
Chế phẩm sau khi đông khô được kiểm 
tra mật độ và phối trộn với chất mang là bột 
khoai mì với tỉ lệ thích hợp, sao cho thành 
phẩm đạt 109 CFU.g-1. Đóng gói thành phẩm 
với khối lượng tịnh 500 g.gói-1.
3.4.	Kết	quả	liều	gây	chết	trung	bình	-	LD50 
của	E. ictaluri	lên	cá	tra	giống
Kết quả khảo sát liều gây chết trung bình 
LD
50 
 được trình bày ở bảng 1.
Hình 1. Khả năng đối kháng E. ictaluri của các chủng thử nghiệm
Nghiệm 
thức
Liều gây độc 
(CFU.ml-1)
Tổng 
chết
(con)
Tổng 
sống
(con)
Tổng chết 
dồn
(con)
Tổng sống 
dồn
(con)
Tỷ lệ chết 
dồn
(%)
NT1 1 x 108 4 26 4 50 7,41
NT2 1 x 109 15 15 19 24 44,19
NT3 1 x 1010 21 9 40 9 81,63
NT4 1 x 1011 30 0 70 0 100,00
PD 0,84481
LD
50
1 x 109
Bảng 1. Kết quả liều gây chết LD50
Kết quả khảo sát ở bảng 1 cho thấy ở mật 
độ E. ictaluri 109 CFU/mL, cá tra chết 50% 
sau khi cảm nhiễm. Dựa vào kết quả LD
50
, 
chúng tôi sử dụng liều 2. LD
50
 tức 2.109 CFU.
ml-1 để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.5.	Khả	năng	bảo	vệ	cá	tra	giống	trong	
điều	kiện	gây	nhiễm	E. ictaluri	của	2	chủng	
vi	khuẩn	B. subtilis	(Q16	và	Q111)
Sau 14 ngày theo dõi, kết quả thí nghiệm 
được chúng tôi trình bày ở hình 2. Nghiệm 
tạo vòng kháng mạnh với đường kính vòng 
kháng khuẩn tương ứng là 23 ± 0,3 mm và 
21,5 ± 0,3 mm. 
3.2.	Tính	an	toàn	của	2	chủng	vi	khuẩn	B. 
subtilis	(Q16	và	Q111)
Cả 2 chủng B. subtilis (Q16 và Q111) đều 
không có khả năng dung huyết ( ) và an toàn 
đối với cá tra giống với tỷ lệ sống là 100% và 
không có sự khác biệt đối với nghiệm thức đối 
chứng. 
γ
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
52 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
Q16) bắt đầu chết. Sau 14 ngày thử nghiệm, số 
lượng cá chết giữa các nghiệm thức có sự khác 
nhau, nghiệm thức NT2 (B. subtilis Q111) và 
nghiệm thức NT3 (phối hợp) có tỉ lệ sống cao 
nhất đạt 100%, nghiệm thức NT1 (B. subtilis 
Q16) có tỉ lệ sống 73,3% và nghiệm thức NT4 
(đối chứng dương) có tỉ lệ sống thấp nhất 
38,7%.
Tỷ lệ sống tương đối (Relative Percentage 
of Survival) tương ứng ở NT1, NT2, NT3 
(%) là 56,44, 100 và 100. Như vậy 2 chủng 
B. subtilis (Q16 và Q111) đã cho thấy có khả 
năng kiểm soát E. ictaluri gây bệnh gan thận 
mủ trên cá tra giống.
thức đối chứng âm (NT5) có 100% cá sống và 
hoạt động bình thường. Ở nghiệm thức NT2, 
NT3, 100% cá thử nghiệm vẫn khỏe mạnh. Ở 
nghiệm thức NT1, NT4 cá có các biểu hiện 
đặc trưng của bệnh gan thận mủ gây ra bởi E. 
ictaluri: mắt đỏ, xuất huyết ở mang và đuôi, 
giải phẫu gan thận có đốm trắng. Tiến hành 
phân lập và định danh từ mẫu gan, thận của 
cá chết cho thấy vi khuẩn trong gan, thận của 
cá là vi khuẩn E. ictaluri. Điều này chứng tỏ 
cá chết ở 2 nghiệm thức NT1 và NT4 là do vi 
khuẩn E. ictaluri gây ra. 
Từ ngày thứ 5 trở đi cá ở nghiệm thức 
NT4 (đối chứng dương) bắt đầu chết, từ ngày 
thứ 6 trở đi, cá ở nghiệm thức NT1 (B. subtilis 
Hình 2. Tỉ lệ sống của cá tra sau khi cảm nhiễm với E. ictaluri
Ghi chú: NT1: cho cá ăn với thức ăn được bổ sung vi khuẩn B. subtilis Q16; NT2: cho cá ăn với thức 
ăn được bổ sung vi khuẩn B. subtilis Q111; NT3: cho cá ăn với thức ăn được bổ sung vi khuẩn B. 
subtilis (Q16 + Q111); NT4: đối chứng dương; NT5: đối chứng âm.
IV.	THẢO	LUẬN
Hai chủng B. subtilis (Q16, Q111) được 
thử nghiệm cho thấy chúng có tính an toàn 
và khả năng bảo vệ cá tra khỏi E. ictaluri 
gây bệnh gan thận mủ. Với phương pháp cấy 
vạch vuông góc, tại các vị trí giao nhau trên 
các đĩa thử nghiệm, chủng vi khuẩn gây bệnh 
E. ictaluri không mọc chứng tỏ chủng này 
mẫn cảm với chất kháng khuẩn do 2 chủng 
B. subtilis Q16 và Q111 tạo ra. Kết quả thử 
nghiệm bằng phương pháp giếng khuếch tán 
của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Võ 
Minh Sơn và ctv., (2011), các chủng Bacillus 
spp. phân lập từ ao nuôi cá tra có hoạt tính 
kháng E. ictaluri với vòng kháng cao.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 53
một số chủng Bacillus spp. phân lập từ ao 
nuôi cá tra. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 
51(3A), 1-16.
Nguyễn Văn Minh (b), Nguyễn Thị Diệu Hiền, 
Nguyễn Thị Thúy, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương 
Nhật Linh, 2013. Tối ưu hóa môi trường lên 
men thu sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus 
subtilis Q16 bằng phương pháp bề mặt đáp 
ứng. Hội nghị Khoa học Công nghệ Quốc tế 
ISCE 2013.
Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh – 
tập 2. NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM, 372 
trang.
Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Thị 
Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm Công nghệ 
Sinh học – tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học. 
NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM, 462 trang.
Võ Minh Sơn, Văn Thị Thuý, Nguyễn Ngọc Tĩnh, 
2011. Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học 
của hai chủng vi khuẩn Bacillus spp. có tiềm 
năng sử dụng là pzrobiotic trong phòng bệnh 
gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon 
hypophthalmus). Tạp chí nông nghiệp và 
phát triển nông thôn ISSNN 0866-7020, 
144-152.
Nguyễn Thị Thúy, Nguyễn Thị Diệu Hiền, Dương 
Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, 2013. Tối ưu 
hóa môi trường lên men thu sinh khối chủng 
vi khuẩn Bacillus subtilis Q111 bằng phương 
pháp đáp ứng bề mặt. Hội nghị CNSH Toàn 
quốc năm 2013, quyển 2, 578-581.
Trần Linh Thước, 2010. Phương pháp phân tích vi 
sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. 
NXB Giáo dục Việt Nam, 70 trang.
Tài	liệu	tiếng	Anh	
Amend, D.F., 1981. Potency testing of fish 
vaccines. Dev. Biol. Standard 49, 447-454.
Capkin, E., Altinok, I., 2009. Effect of dietary 
probiotic supplementation on prevention/ 
treatment of yersiniosis disease. Journal of 
Applied Microbiology 106, 1147-1149.
Chao, R., Abel, C., Malachi, A.W., Nancy, C., Bui, 
C.T.D., Joseph, C.N., Joseph, W.K., EiL, 
O., Craig, L.B., Jeffery, S.T., Mark, R.L., 
2012. Identification of Bacillus strains for 
Từ thí nghiệm khả năng bảo vệ cá tra 
giống trong điều kiện gây nhiễm E. ictaluri, 
có thể nhận thấy rằng 100% cá ở nghiệm thức 
NT5 (đối chứng âm) sống và hoạt động bình 
thường nghĩa là các yếu tố môi trường không 
ảnh hưởng đến cá. Đồng thời, cá ở các nghiệm 
thức NT4 (đối chứng dương), NT1 (B. subtilis 
Q16) chết lần lượt 61,3 và 26,7 % là do nhiễm 
vi khuẩn E. ictaluri. Nghiệm thức NT2 (B. 
subtilis Q111) và NT3 (B. subtilis Q16 và 
Q111) 100% cá thử nghiệm vẫn khỏe mạnh 
cho thấy rằng hai chủng này có khả năng bảo 
vệ cá tra giống khỏi E. ictaluri gây bệnh gan 
thận mủ. Đặc biệt, bổ sung chủng B. subtilis 
Q111vào thức ăn riêng lẻ hay kết hợp với B. 
subtilis Q16 thì tỉ lệ sống của cá đạt 100%. 
Chao và ctv., (2012) cũng đã báo báo rằng khi 
bổ sung Bacillus vào thức ăn có khả năng kiểm 
soát E. ictaluri gây bệnh trên cá tra.
V.	KẾT	LUẬN
Với những kết quả thực nghiệm như 
đã trình bày ở trên, chúng tôi kết luận rằng 2 
chủng B. subtilis (Q16 và Q111) vừa an toàn 
vừa có khả năng bảo vệ cá tra giống chống 
lại E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá 
tra trong điều kiện thí nghiệm. Đây là những 
chủng có tiềm năng lớn để đưa vào ứng dụng 
làm probiotic sử dụng trong nuôi cá tra.
TÀI	LIỆU	THAM	KHẢO
Tài	liệu	tiếng	Việt
Lại Thúy Hiền, Đỗ Bá Tú, Đỗ Thu Phương, Phạm 
Thị Hằng, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga, 
Võ Mai Hương, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn 
Thu Thủy, Bùi Lê Thanh Nhàn, 2008. Nghiên 
cứu sản xuất chế phẩm sinh học Nitrobac 
ứng dụng trong xử lý nước nuôi tôm tại Thừa 
Thiên - Huế. Tạp chí Công nghệ Sinh học 
62, 249-256.
Nguyễn Văn Minh (a), Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, 
Đỗ Phương Quỳnh, Võ Ngọc Yến Nhi, 
Dương Nhật Linh, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 
Lê Hồng Phước, 2013. Khả năng kiểm soát 
sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh của 
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
54 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, 
J.T., Williams, S.T., 1994. Bergey's Manual 
of Determinative Bacteriology 9th edition, 
Chapper V, 816 pages.
Kwon, G.H., Lee, H.A., Park, J.Y., Kim, J.S., Lim, 
J., Park, C.S., Kwon, D.Y., Kim, Y.S., Kim, 
J.H., 2009. Development of a RAPD-PCR 
method for identification of Bacillus species 
isolated from Cheonggukjang. International 
Journal of Food Microbiology 129, 282-287.
Newaj-Fyzul, A., Adesiyun, A.A., Mutani, A., 
Ramsubhag, A., Brunt, J., Austin, B., 2007. 
Bacillus subtilis AB1 control Aeromonas 
infection in rainbow trout (Oncohynchus 
mykiss, Walbaum). Journal of Applied 
Microbiology 103, 1-6.
Purivirojkul, W., Areechon, N., 2007. Application 
of Bacillus spp. Isolated from the Intestine 
of BlackTiger Shrimp (Penaeus monodon 
Fabricius) from Natural Habitat for Control 
Pathogenic Bacteria in Aquaculture. 
Kasetsart J (Nat. Sci.) 41, 125-132.
Reed, J.L., Muench, H., 1938. A simple method 
of estimating fifty percent Endpoints. The 
American journal of hygiene 27, 493-497.
biological control of catfish pathogens. Plos 
one 7(9), 1-9.
Chythanya, R., Karunasagar, I., 2002. Inhibition 
of shrimp pathogenic vibrios by a marine 
Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208, 
1-10.
Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., 
Ngoc, N.T.N., Ferguson, H.W., 2002. 
Indentification of E. ictaluri from diseased 
freshwater catfish, P. hypoththalmus 
(Sauvage), cultured in the Mekong Delta, 
Vietnam. Journal of Fish Diseases 25 (12), 
733-736.
Essa, A.M., El-Serafy, S.S., El-Ezabi M.M., 
Daboor, M.S., Esmael, A.N., Lall, P.S., 
2010. Effect of different dietary probiotics 
on growth, feed utilization and digestive 
enzymes activities of Nile Tilapia, 
Oreochromis niloticus. Journal of the 
Arabian Aquaculture society 5(2), 143-161.
Gerhardt, P., Murray, R.G.E., Costilow, R.N., 
Nester, E.W., Wood, W.A., Krieg, N.R., 
Phillips, G.B., 1981. Manual of methos for 
general bacteriology. American Society for 
Microbilogy.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 55
BIOCONTROL CAPABILITY OF Edwardsiella ictaluri IN TRA 
CATFISH FINGERLINGS (Pangasianodon hypophthalmus) 
BY Bacillus subtilis Q16 AND Bacillus subtilis Q111 UNDER 
EXPERIMENTAL INFECTION CONDITIONS
Nguyen Van Minh1*, Do Phuong Quynh1, Vo Ngoc Yen Nhi1, 
Duong Nhat Linh1, Nguyen Thi Ngoc Tinh2, Le Hong Phuoc2
ABSTRACT
Currently, Bacillary Necrosis of Pangassius (BNP) in Tra catfish (Pangasianodon 
hypophthalmus) caused by bacteria Edwardsiella ictaluri brings about detrimental losses 
to catfish farming. Many measures have been developed for prevention and treatment of 
BNP, among them biological control measure is being focused. In this study, two strains 
of Bacillus subtilis (Q16, Q111) have showed strong inhibition toward E. ictaluri using 
cross-streak and well-diffusion methods. At the same time, trials on safety and protection 
capability assessment were conducted on Tra catfish larvae challenged with E. ictaluri. 
The results indicated both strains (Q16 and Q111) are safe for Tra catfish and have a good 
protection ability toward the host with RPS of 56.44% for B. subtilis Q16, of 100% for B. 
subtilis Q111 and 100% for B. subtilis (Q16 + Q111). These results show that these two 
strains of B. subtilis, that were isolated from Tra catfish ponds, can be potential probiotic 
strains that can be used in disease prevention for farmed Tra catfish.
Keywords: Biocontrol, Bacillus subtilis Q16, Bacillus subtilis Q111, Bacillary Necrosis 
Pangasius (BNP), Edwardsiella ictaluri.
Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015
Ngày duyệt đăng: 07/8/2015
1Falcuty of Biotechnology, Open University, HCMC 
*Email: nguyenminhou@gmail.com
2Research Institute of Aquaculture No.2