Ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá

100 Avant Genetic 
Loài sán Ký hiệu mẫu Loại mẫu 
(ADN)
Nguồn mẫu Ký chủ Nguồn gen ITS-2 
H. pumilio Hpu (TL1) Sán trưởng 
thành
Thái Lan Người Ando và ctv., 2001
H. pumilio HpM (TL) Metacercaria Thái Lan Cá Nghiên cứu này
Haplorchis sp. HspMND (VN) Metacercaria Việt Nam Cá Nghiên cứu này
H. pumilio Hpu 
(AY245706)
Dzikowski và ctv., 
2004; AY245706
Haplorchis sp. HspND(VN) Sán trưởng 
thành
Việt Nam Người Nghiên cứu này
Haplorchis sp. HspNDV(VN) Sán trưởng 
thành
Việt Nam Người Nghiên cứu này
H. taichui Hta(TL1) Sán trưởng 
thành
Thái Lan Người Ando và ctv., 2001
Haplorchis sp. HspMND2(VN) Metacercaria Việt Nam Cá Nghiên cứu này
H. taichui Hta(AY245705) Dzikowski và ctv., 
2004; AY245705
O. viverrini Ovi(AY584735) Sanath và ctv., 
2004; AY584735
O. viverrini Ovi(TL1) Sán + ấu trùng Thái Lan Người Ando và ctv., 2001
C. sinensis Csi(SKR) Lee và ctv., 1999; 
AF217095
Bảng 1. Danh sách mẫu, nguồn gốc của mẫu trong nghiên cứu và nguồn gen tham khảo
2.2.	Phân	tích	ITS-2
Quá trình phân tích sinh học phân tử 
được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của 
Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh 
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
(Hà Nội).
Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành và ấu 
trùng sán được tách chiết ADN tổng số bằng 
QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc., USA). 
Sau khi thu được ADN tổng số tiến hành 
thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt: 
Nhiệt độ để bung liên kết là 94oC trong 1 phút, 
nhiệt độ bám mồi là 50oC trong 1 phút, nhiệt 
độ cung cấp cho quá trình tổng hợp chuỗi 
ADN là 72oC trong vòng 2 phút. Toàn bộ quá 
trình thực hiện phản ứng PCR là 35 chu kỳ (Le 
Thanh Hoa và ctv., 2002).
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 59
khảo (Ando và ctv., 2001) và so sánh với gen 
ITS-2 của một số loại sán lá truyền lây khác 
(Bảng 1). Các chương trình GENEDOC2.5 và 
MEGA3.1 được sử dụng để phân tích và so 
sánh về thành phần nucleotide (Nicholas và 
Nicholas, 1999; Kumar và ctv., 2004).
III.	KẾT	QUẢ	NGHIÊN	CỨU
3.1.	Sản	phẩm	PCR	vùng	ITS-2
Analyzer tại Viện Công nghệ sinh học. Chuỗi 
nucleotide được xử lý bằng chương trình 
SeqEd1.03, sau đó so sánh sử dụng chương 
trình AssemblyLIGN v1.9c và MacVector8.2 
(Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So 
sánh trình tự chuỗi ITS-2 của mẫu nghiên 
cứu với trình tự gen ITS-2 của H. taichui và 
H. pumilio từ ngân hàng gen, từ tài liệu tham 
Hình 2. Sản phẩm PCR vùng gen ITS-2 trên thạch agarose 1%
M: chỉ thị ADN (Lamda cắt bằng HindIII); 1: Hta (TL), mẫu H. taichui của Thái Lan; 2: HpM (TL), mẫu 
metacercaria H. pumilio của Thái Lan; 3: HspMND (VN), mẫu metacercaria Haplorchis sp. thứ nhất của 
Việt Nam; 4: HspND (VN), mẫu Haplorchis sp. của Việt Nam; 5: HspMND2 (VN), mẫu metacercaria 
Haplorchis sp. thứ 2 của Việt Nam
Kết quả cho thấy có sự sai khác về 
chiều dài của vùng gen ITS-2 giữa các mẫu 
Haplorchis sp. thu được ở Việt Nam và giữa 
mẫu H. taichui và H. pumilio của Thái Lan 
(mẫu đã được xác định hình thái học). Độ dài 
của vùng gen ITS-2 giới hạn giữa cặp mồi (3SF 
và BDR) của H. taichui khoảng 0,6 kb và của 
H. pumilio khoảng 0,4 kb. Mẫu sán Haplorchis 
sp. của Việt Nam cũng có độ dài vùng gen ITS-
2 tương tự như mẫu sán của Thái Lan (Hình 2).
3.2.	Trình	tự	vùng	gen	ITS-2	
Trình tự nucleotide các mẫu nghiên cứu 
được trình bày ở Hình 3. Kết quả giải trình 
tự cho thấy có sự sai khác về độ dài gen ITS-
2 giữa H. taichui và H. pumilio. Gen ITS-2 
của H. taichui dài hơn H. pumilio do có một 
đoạn 154 nucleotide từ nucleotide thứ 198 đến 
nucleotide 352 được chèn vào (Hình 3). Các 
mẫu sán ruột nhỏ và ấu trùng của chúng thu 
được từ người và cá ở Việt Nam bao gồm mẫu 
HspMND2 (VN) có độ dài gen ITS-2 là 446 
bp và mẫu HspMND (VN) có độ dài gen ITS-
2 là 290 bp.
3.3.	Sự	tương	đồng	của	nucleotide	trong	gen	
ITS-2	
Mức độ tương đồng các nucleotide được thể 
hiện trong Bảng 2.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
60 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
Hình 3. So sánh trình tự nucleotide gen ITS-2 của các mẫu sán lá ruột nhỏ Haplorchis Việt Nam, 
Thái Lan và sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini).
Ghi chú: Sai khác trình tự của các chủng so với Hpu (TL1) biểu thị bằng chính ký hiệu nucleotide của 
chúng; dấu (.) biểu thị sự giống nhau; dấu (-) không có nucleotide tương ứng.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 61
(VN) có độ dài gen ITS-2 là 446 bp, tương 
đương ITS-2 của H. taichui; và mẫu HspMND 
(VN) có độ dài gen ITS-2 là 290 bp, tương 
đương gen ITS-2 của H. pumilio.
So sánh giữa các mẫu sán và ấu trùng 
thu được ở Việt Nam với H. taichui và H. 
pumilio của Thái Lan và so sánh với một số 
sán lá truyền lây khác như sán lá gan nhỏ (C. 
sinensis và O. viverrini) về mức độ tương 
đồng các nucleotide cho thấy mẫu H. pumilio 
((HpuM (TL) nguồn gốc từ Thái Lan) phân 
tích ở nghiên cứu này và mẫu của Ando và 
ctv., (2001) (từ Thái Lan) có sự tương đồng 
nucleotide của gen ITS-2 là 96% và giữa 
mẫu HspMND (VN) với mẫu H. pumilio của 
Bảng 2. Sự tương đồng nucleotide trong gen ITS-2 ở một số loài sán lá truyền lây qua cá
Ghi chú: 1: Hpu (TL1); 2: HpuM (TL); 3: Hpu (AY245706); 4: HspMND (VN); 5: HspND (VN); 
6: HspNDV (VN); 7: Hta (TL1); 8: Hta (TL); 9: HspMND2 (VN); 10: Hta (AY245705); 11: Ovi 
(AY584735); 12: Ovi (TL1); 13: Csi (SKR)
IV.	THẢO	LUẬN
Từ kết quả giải trình tự gen cho thấy có 
sự sai khác về độ dài gen ITS-2 giữa H. taichui 
và H. pumilio. Đối với H. taichui, gen ITS-
2 có độ dài là 445-446 bp còn đối với mẫu 
sán H. pumilio là 290 bp. Gen ITS-2 của H. 
taichui dài hơn H. pumilio do có một đoạn 
154 nucleotide từ nucleotide thứ 198 đến 
nucleotide 352 được chèn vào. Sự sai khác 
nhiều về trình tự sắp xếp các nucleotide giữa 
H. taichui và H. pumilio chủ yếu xảy ra ở các 
vị trí sau đoạn chèn, còn các vị trí trước đoạn 
chèn có sự tương đồng lớn. Các mẫu sán ruột 
nhỏ và ấu trùng của chúng thu được từ người 
và cá ở Việt Nam bao gồm mẫu HspMND2 
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
62 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
V.	KẾT	LUẬN
Kết quả giải trình tự gen ITS2 sán lá ruột 
nhỏ Haplorchis spp. ở các giai đoạn cercariae, 
metacercariae và sán trưởng thành được thu 
từ ốc, cá, chó mèo, người ở Nam Định, Nghệ 
An Việt Nam và vùng Đông Bắc Thái Lan 
cho thấy có sự sai khác về độ dài đoạn gen 
ITS2 giữa sán lá ruột nhỏ loài H. taichui và 
H. pumilio. Đối với H. taichui, gen ITS2 có 
độ dài là 445 - 446 bp còn đối với mẫu sán H. 
pumilio là 290 bp. 
Giữa 2 loài sán lá ruột nhỏ H. taichui 
và H. pumilio có sự sai khác về độ dài và trật 
tự gen ITS-2 được thể hiện ở sự chèn đoạn 
gen 154 nucleotide, làm cho đoạn gen ITS-2 
của H. taichui dài hơn đoạn gen ITS-2 của H. 
pumilio.
Có rất ít sự sai khác về trình tự nucleotide 
trong gen ITS-2 của H. pumilio giữa mẫu sán 
của Việt Nam và mẫu sán của Thái Lan trong 
nghiên cứu này (tương đồng đạt 99%) và có sự 
sai khác không đáng kể giữa mẫu sán của Thái 
Lan trong nghiên cứu này với mẫu sán Thái 
Lan trong nghiên cứu của các tác giả khác. 
Có sự giống nhau hoàn toàn về trình tự 
sắp xếp nucleotide trong gen ITS-2 của H. 
taichui giữa mẫu sán Việt Nam và mẫu sán 
Thái Lan trong nghiên cứu này và giống nhau 
gần như tuyệt đối với mẫu sán Thái Lan của 
tác giả Ando và ctv., (2001).
Nghiên cứu này giúp rút ngắn trong 
nghiên cứu vòng đời của sán lá ruột nhỏ nói 
riêng và sán lá song chủ nói chung.
TÀI	LIỆU	THAM	KHẢO
Tài	liệu	tiếng	Việt
Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích 
Nga, Nguyễn Thị Tuyết Nhung và Anders 
Dalgaard, 2007a. Phân biệt sán lá ruột nhỏ 
Haplorchis taichui và H. pumilio với các loài 
sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal 
transcribed spacer). Tạp chí Khoa học kỹ 
thuật nông nghiệp, Trường Đại học Nông 
nghiệp 1. Tập V số 1/2007. NXB Nông 
nghiệp, Trang 36-43. ISSN: 1895-0004.
Thái Lan trong nghiên cứu này HpuM (TL) 
và mẫu phân tích của Ando và ctv., (2001) có 
sự tương đồng nucleotide tương ứng là 99 và 
96%. Trong khi đó sự tương đồng nucleotide 
trong các mẫu H. pumilio của Thái Lan và cả 
mẫu HspMND (VN) so với Hpu (AY245706) 
từ Ngân hàng gen chỉ đạt 94%. Mức độ tương 
đồng nucleotide giữa các mẫu (1-4) đạt tỷ lệ 
tương đối cao (94-99%) tỷ lệ này phản ánh 
tương đồng thường thấy ở trong một loài. Như 
vậy có thể kết luận mẫu HspMND (VN) của 
Việt Nam là H. pumilio.
Đối với mẫu H. taichui có nguồn gốc Thái 
Lan trong nghiên cứu này Hta (TL) với mẫu 
Hta (TL1) trong nghiên cứu của Ando và ctv., 
(2001) cho thấy có sự tương đồng nucleotide 
là 99%. Trong khi đó mẫu HspMND2 (VN) 
có sự tương đồng rất cao từ 99-100% so với 
mẫu H. taichui của Thái Lan và có sự tương 
đồng rất thấp với các mẫu H. pumilio chỉ đạt 
từ 52-54%, và đây là mức độ tương đồng 
thường thấy ở 2 loài khác nhau. Vì vậy có thể 
kết luận mẫu HspMND2 (VN) của Việt Nam 
là H. taichui.
Đối với mẫu ký hiệu HspNDV (VN) khi 
phân tích sự tương đồng nucleotide vùng gen 
ITS-2 cho thấy tương đồng tuyệt đối 100% so 
với O. viverrini từ Ngân hàng gen. Le Thanh 
Hoa và ctv., (2003) cho rằng sán lá gan nhỏ O. 
viverrini chủ yếu phân bố ở vùng Nam Trung 
bộ và phía Nam, nhưng mẫu HspNDV (VN) 
chúng tôi phân tích ở đây lại được tìm thấy ở 
vùng Nam Định. Điều này cho thấy cần thiết 
có nghiên cứu bổ sung về nguồn gốc để có kết 
luận chắc chắn hơn.
Trình tự gen ITS-2 của Hta (AY245705) 
thu thập từ Ngân hàng gen đem so sánh với 
mẫu nghiên cứu của chúng tôi và các mẫu 
tham khảo khác cho thấy có tỷ lệ tương đồng 
rất thấp (45%) với nhóm H. taichui và 54-68% 
với nhóm H. pumilio. Vậy chắc chắn trình tự 
này trong Ngân hàng gen là không đúng với 
H. taichui.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 63
Kim Van Van, Anders Dalgaard, David Blair and 
Thanh Hoa Le, 2009. Haplorchis pumilio & 
H. taichui in Vietnam discriminated using 
ITS-2 DNA Se quence data from adults and 
larvae. Experimental Parasitology 123 Issue 
2, October, 2009. Pages 141-151. ISSN 
0014-4894
Kumar, S., Tamura, K., Nei, M., 2004. MEGA3: 
Integrated Software for Molecular 
Evolutionary Genetics Analysis and 
Sequence Alignment. Briefings in 
Bioinformatics 5, 150-163.
Le, T.H., N.V., Chuong, N.V., De, P. Sithitharworn, 
N.B., Nga, T.N., Trung, L.K., Thuan, 2003. 
Report on molecular analysis of Opisthorchis 
viverrini collected from Phu Yen province. 
Proceedings of National Conference on 
Molecular Biology and Biochemistry, Hanoi 
(22-24.10.2003).
Le, T.H., Blair, D., and McManus, D.P., 2002. 
Mitochondrial genomes of parasitic 
flatworms. Trends Parasitol, 18: 206-213.
Nicholas, K.B., and H.B., Nicholas, 1999. 
GeneDoc: a tool for editting and annotating 
multiple sequence alignments. Distributed 
by authors.
Tesana, S., Srisawangwonk, T., Kaekes, S., 
Sithithaworn, P., Kanla, P., Arunyanart, C., 
1991. Egg shell morphology of the small 
eggs of human trematodes in Thailand. 
Southeast Asian J Trop Med Public Health 
1991; 22: 631-6.
LỜI	CẢM	ƠN
Tác giả gửi lời cảm ơn Tổ chức DANIDA và 
dự án FIBOZOPA đã cung cấp kinh phí và tạo 
mọi điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu này.
Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề, 
Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Tuyết 
Nhung và Anders Dalgaard, 2007b. Giám 
định sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và 
H. pumilio sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal 
transcribed spacer). Y học thành phố Hồ Chí 
Minh. Chuyên đề ký sinh trùng, Trường Đại 
học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Tập 11 *Phụ 
bản của số 2* 2007. Trang 104-110. 
Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề và 
Anders Dalgaard, 2007c. Ứng dụng sinh học 
phân tử xác định các giai đoạn phát triển của 
sán lá truyền lây qua cá từ các ký chủ trong 
vòng đời. Hội nghị chuyên đề chào mừng 
105 năm thành lập trường ĐH Y Hà Nội: 
“Y-sinh học phân tử ứng dụng trong ngành 
ký sinh trùng”. Trường Đại học Y Hà Nội. 
Trang 84-91.
Tài	liệu	tiếng	Anh
Ando, K., Sathithaworn, P., Nuchjungreed, C., 
Tesana, S., Srisawangwong, T., Limviroj, W., 
and Chinzei, Y., 2001. Nucleotide sequence 
of mitochondrial CO I and ribosomal ITS-2 
genes of Opisthochis viverrini in Northeast 
Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public 
Health 2001; 32: 17-22.
Bowles, J., Blair, D., McManus, D.P., 1995. 
A molecular phylogeny of the human 
schistosomes. Mol Phylogenet Evol 4: 103-
109.
Dzikowski, R., Levy, M.G., Poore, M. F., 
Flowers, J. R., and Paperna, I., 2004. Use 
of rDNA polymorphism for identification of 
Heterophyidae infecting freshwater fishes. 
Dis Aquat Org 2004; 59: 35-41.
Kim Van Van and Dinh Thi Thuy, 2008. 
Comparison of Diagnostic Methods for the 
Detection of Parasites in Fish. Journal of 
Science and Development. Hanoi University 
of Agriculture. Special Issue April 2008. 
Agricultural Publishing House, Pages 136-
144. ISSN: 1895-0004.
VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
64 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
APPLIED BIOLOGY TECHNOLOGY IN DIAGNOSIS PARASITE 
TRANSMIT VIA FISH
Kim Van Van1*
ABSTRACT
Biotechnology was applied in general aquaculture and special diagnostic aquaculture 
pathogents. This paper will introduce applying biotechnology in zoonotic 
parasitological diagnostics as small intestine fluke: Haplorchis spp are tiny trematodes 
to be found in the small intestines of various definitive hosts such as human, birds, cats, 
dogs and rats. Human and other definitive hosts are infected by eating raw freshwater 
fishes containing encysted metacercariae. Haplorchis spp. is not easy to discriminate 
from other trematodes due to their minute size, similar morphology of eggs, cercaria, 
metacercaria and adult worm. A molecular method, for the first time in Vietnam, was 
applied to identify H. pumilio and H. taichui based on amplification of ITS-2 using 
forward primer, 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ and reverse 
primer BD2R: 5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3-BD2R) with annealing at 50oC 
in the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing for analyzing the nucleotide 
composition. Samples including adult worm and metacercariae were collected on 
human and fish in Nam Dinh (Vietnam) and Bangkok (Thailand). Length of ITS-
2 specific for H. taichui is 446bp; and for H. pumilio is 290bp. ITS-2 sequence in 
H. taichui longer than that in H. pumilio is due to the insertion of 154 nucleotides 
between nucleotide 198 and 352. There was high identity rate of nucleotides (99-
100%) in the ITS-2 gene between Vietnamese and Thai H. taichui or H. pumilii 
respectively.
Keywords: Haplorchis spp, H. taichui, H. pumilio, PCR, identity.
Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015
Ngày duyệt đăng: 07/8/2015
1Vietnam National University of Agriculture
*Email: kvvan@vnua.edu.vn