Thử nghiệm in vitro đối với kháng sinh thích hợp trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính

ẢN II
parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập 
được từ các mẫu tôm bệnh tại Việt Nam làm 
cơ sở cho các nghiên cứu thử nghiệm cho việc 
phòng trị loại bệnh này trên tôm.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Bảy chủng V. parahaemolyticus gây bệnh 
AHPND gồm 5 chủng phân lập trên tôm bệnh 
AHPND tại ao nuôi miền Nam và 2 chủng trên 
tôm bệnh tại miền Bắc (Bảng 1) được chọn để 
thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu. 
Mẫu được lưu trữ trong glycerol 20% và bảo 
quản -70oC tại Trung tâm Quan Trắc, Viện 
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Bảng 1. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên tôm
STT Ký hiệu mẫu Phân lập từ Tỉnh
1 KG11T1 Tôm thẻ Kiên Giang
2 ST8T Tôm sú Sóc Trăng
3 ST11T Tôm sú Sóc Trăng
4 ST13T Tôm thẻ Sóc Trăng
5 CMT14 Tôm thẻ Cà Mau
6 PR15.10 Tôm thẻ Nghệ An
7 PR15.20 Tôm thẻ Nghệ An
2.2. Sàng lọc danh mục kháng sinh thử 
nghiệm
Căn cứ vào đặc tính sinh học cũng như cơ 
chế gây bệnh của tác nhân gây bệnh; căn cứ vào 
bản chất hóa học của kháng sinh; kết hợp với kết 
quả các nghiên cứu trước; điều tra bổ sung của 
nghiên cứu này về sử dụng loại kháng sinh, mức 
độ kháng, hiệu quả,trong nuôi tôm. Tiến hành 
chọn 5 loại kháng sinh có tỉ lệ nhạy cao nhất đối 
với các mẫu V. parahaemolyticus đã phân lập từ 
3 miền để thử nồng độ ức chế tối thiểu làm cơ sở 
cho việc chọn liều thử nghiệm trên tôm.
2.3. Phương pháp xác định nồng độ ức 
chế tối thiểu-MIC (Minimal inhibitory 
concentration) 
MIC được xác định theo quy trình có thay 
đổi của Ruangpan (2004) bằng cách pha loãng 
thuốc kháng sinh trong môi trường đĩa thạch 
với 6 loại kháng sinh đã chọn. Giá trị MIC 
được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc 
kháng sinh, ở đó không có sự phát triển của vi 
khuẩn (Ruangpan, 2004). Các bước tiến hành 
như sau:
2.3.1. Chuẩn bị các dung dịch kháng sinh
Pha dung dịch kháng sinh gốc: pha 10ml 
dung dịch gốc nồng độ 1.280 µg/ml theo công 
thức: X(g) = [10 (ml) x 1.280 (µg/ml) x 100] / a. 
Trong đó: a là % hoạt lực của kháng sinh. Kháng 
sinh bột được pha với dung môi thích hợp (nước 
cất được dùng pha 5 loại kháng sinh sử dụng 
trong nghiên cứu này). Cho một lượng dung 
môi vừa đủ để hòa tan hoàn toàn kháng sinh, bồi 
phụ đủ thể tích bằng dung môi hoà tan. Từ dung 
dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ thấp nhất 
cần dùng là 2,5 µg/ml (10 nồng độ pha loãng là 
1.280 µg/ml, 640 µg/ml, 320 µg/ml, 160 µg/ml, 
80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/
ml, 2,5 µg/ml). 
2.3.2. Chuẩn bị các đĩa thạch kháng sinh
Đĩa thạch Mueller-Hinton Agar được chuẩn 
bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất, có bổ 
sung 2% muối và hòa tan vào môi trường nước 
cất. Đun sôi để hoà tan hoàn toàn thạch và hấp 
tiệt trùng 120oC/15 phút, để nguội môi trường 
tới 50oC. Sau đó, cho vào đĩa petri 9 ml thạch 
và 1ml dung dịch kháng sinh cần dùng (10 nồng 
44 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
độ kháng sinh đã được pha ở trên, mỗi nồng độ 
3 đĩa) và lắc đều. Các đĩa thạch được dùng ngay 
trong ngày. Đánh dấu phía trên và phía dưới đĩa 
thạch để tránh nhầm lẫn số thứ tự chủng khi 
đọc kết quả. Hai đĩa môi trường MHA không 
có kháng sinh cũng được chuẩn bị để làm chứng 
dương.
2.3.3. Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn 
dịch vi khuẩn
7 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 
được chọn làm thử nghiệm được cấy vào môi 
trường thạch dinh dưỡng (BHIA), ủ 18-24 giờ ở 
30oC để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Các 
khuẩn lạc hòa tan vào 10 ml nước muối 2% vô 
trùng đến khi đạt nồng độ 108 vi khuẩn/ml (độ 
đục của huyền dịch vi khuẩn tương ứng với độ 
đục chuẩn 0,5 McFarland). Pha loãng 100 lần 
huyền dịch vi khuẩn này để được huyền dịch 
nồng độ 106 vi khuẩn/ml.
2.3.4. Tiến hành
Hút 10 µl huyền dịch vi khuẩn nồng độ 
106 vi khuẩn/ml cho vào mỗi vị trí giếng/
vòng tròn (nhỏ giọt) trên đĩa thạch MHA với 
10 nồng độ kháng sinh khác nhau (từ nồng 
độ thấp đến nồng độ cao), mỗi nồng độ lặp 
lại 3 lần. Hai đĩa môi trường MHA không có 
kháng sinh cũng được cho 10 µl huyền dịch vi 
khuẩn để làm chứng dương. Sau đó để các đĩa 
thạch ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô, lộn 
ngược các đĩa và ủ ở 300C trong vòng 18-24 
giờ.
2.3.5. Đọc và phân tích kết quả
Trước tiên kiểm tra sự phát triển của các 
chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 2 đĩa thạch đối 
chứng không có kháng sinh. Nếu các chủng 
đảm bảo mọc tốt thì tiếp tục đọc kết quả của 
các chủng thử nghiệm. Nếu các chủng vi khuẩn 
không mọc thì tiến hành làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng 
độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao 
nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi 
trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển 
(mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-2 khuẩn 
lạc mọc). Kết quả MIC của các chủng với mỗi 
kháng sinh được ghi nhận lại. Ở nồng độ thấp 
nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được 
ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó (≤). 
Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn 
thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là 
lớn hơn nồng độ đó (≥).
2.4. Phương pháp xác định nồng độ ức chế 
50% (IC50) và 90% (IC90)
Sau khi xác định được giá trị MIC, IC
50
và IC
90
 được tính toán để xác định liều lượng 
kháng sinh thử nghiệm điều trị bệnh trên động 
vật nhằm tìm ra loại kháng sinh điều trị bệnh 
hiệu quả. IC
50
 và IC
90
 được tính toán theo công 
thức sau (Ruangpan, 2004):
IC
50
 =
A+B
, trong đó
2
A =
50 x nồng độ MIC gần nhất của các chủng vi khuẩn bị ức chế thấp hơn 50% 
tỉ lệ % gần nhất thấp hơn 50%
B =
50 x nồng độ MIC gần nhất của các chủng vi khuẩn bị ức chế cao hơn 50% 
tỉ lệ % gần nhất cao hơn 50% 
IC
90
 =
C+D
, trong đó
2
C =
90 x nồng độ MIC gần nhất của các chủng vi khuẩn bị ức chế thấp hơn 90% 
tỉ lệ % gần nhất thấp hơn 90% 
D =
90 x nồng độ MIC gần nhất của các chủng vi khuẩn bị ức chế cao hơn 90% 
tỉ lệ % gần nhất cao hơn 90%
45TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
2.5. Phương pháp phân tích số liệu
Dữ liệu được nhập và phân tích thống kê 
bằng phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA).
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả sàng lọc danh mục kháng sinh 
thử nghiệm
Căn cứ vào kết quả thử kháng sinh đồ của 
47 mẫu V. parahaemolyticus đã phân lập năm 
2015 (Báo cáo tổng kết đề tài, 2015). Năm loại 
kháng sinh được chọn do có tỉ lệ nhạy cao nhất 
đối với các mẫu V. parahaemolyticus đã phân 
lập là Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycycline, 
Gentamicin và Tetracyline. Oxytetracycline là 
loại kháng sinh đang được người nuôi sử dụng 
phổ biến (qua điều tra thực tế), cũng được lựa 
chọn cho thử nghiệm. Sáu loại kháng sinh này 
được dùng để thử nồng độ ức chế tối thiểu làm 
cơ sở cho việc chọn liều thử nghiệm trên tôm. 
Norfloxacin và Ciprofloxacine bị cấm sử dụng 
trong nuôi trồng thủy sản từ tháng 10/2016 
(thông tư 10/2016/TT-BNNPTNT). Tuy nhiên, 
2 loại kháng sinh này được sử dụng khá phổ 
biến tại ao nuôi nên cũng được chọn cho thử 
nghiệm này.
3.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối 
thiểu-MIC
Kết quả cho thấy nồng độ MIC của 7 
chủng V. parahaemolyticus với Norfloxacin 
≤ 0,25-1 mg/l, Ciprofloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, 
Doxycycline 1-32 mg/l, Gentamicin 4-16 mg/l, 
Tetracycline 1-128 mg/l và Oxytetracycline 1 
- ≥ 128 mg/l (Bảng 2). Nghiên cứu trước cho 
thấy kết quả MIC của V. parahaemolyticus 
phân lập trên tôm nuôi ở Thái Lan với 
Gentamicin < 1-2 mg/l và Oxytetracycline < 
0,5-64 mg/l (Yano et al., 2014). Kết quả của 
Vaseeharan et al., (2005) cho thấy tất cả các 
chủng V. parahaemolyticus phân lập từ ao nuôi 
tôm kháng với oxytetracycline, với MIC dao 
động từ 32,5-88,6 mg/l.
Bảng 2. Nồng độ ức chế tối thiểu của các chủng V. parahaemolyticus với 6 loại kháng sinh
Kháng sinh
Số chủng 
vi khuẩn
Số chủng vi khuẩn với MIC (mg/l)
≤ 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 ≥ 128
Norfloxacin 7 3 2 2
Ciprofloxacin 7 2 4 1
Doxycycline 7 3 1 1 1 1
Gentamicin 7 1 5 1
Tetracycline 7 2 2 1 2
Oxytetracycline 7 4 1 2
3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế IC50 
và IC90
Dựa trên kết quả MIC, IC
50
 và IC
90
 của 6 loại 
kháng sinh với các chủng V. parahaemolyticus 
được trình bày qua Bảng 3. IC
50
 của Norfloxacin 
có giá trị thấp nhất là 0,32 µg/ml và Gentamicin 
có giá trị cao nhất là 9,33 µg/ml. IC
90
 của 
Ciprofloxacin có giá trị thấp nhất là 0,71 µg/
ml và Tetracycline có giá trị cao nhất là 97,92 µg/
ml. Chưa xác định được liều IC
50
 và IC
90
 của 
Oxytetracycline với 10 nồng độ kháng sinh đã 
thử nghiệm. Dung và ctv., (2010) đã báo cáo giá 
trị IC50 và IC90 của Gentamicin trên vi khuẩn 
Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên 
cá tra lần lượt là 2 và 4 µg/ml.
46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
IV. KẾT LUẬN
Nồng độ MIC của 7 chủng V. 
parahaemolyticus với Norfloxacin ≤ 0,25-1 
mg/l, Ciprofloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Doxycycline 
1-32 mg/l, Gentamicin 4-16 mg/l, Tetracycline 
1-128 mg/l và Oxytetracycline 1 - ≥ 128 mg/l.
IC
50
 của Norfloxacin, Ciprofloxacin, 
Doxycyclin, Gentamicin và Tetracycline lần lượt 
là 0,32, 0,36, 1,46, 9,33 và 1,75 µg/ml. IC
90 
lần 
lượt là 0,76, 0,71, 22,80, 11,40 và 97,92 µg/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Lê Hồng Phước, Nguyễn Diễm Thư, Nguyễn Văn 
Hảo, Cao Thành Trung, Nguyễn Thị Hiền, 
Nguyễn Hồng Lộc, Đoàn Văn Cường, 2015. 
Nghiên cứu quy trình sử dụng kháng sinh hợp 
lý trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 
trên tôm nuôi nước lợ ở Việt Nam. Báo cáo tổng 
kết năm 2015. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng 
Thủy sản II, 43 trang.
Tài liệu tiếng Anh
Clinical and Laboratory Standards Institute, 
2014. Performance standards for antimicrobial 
susceptibility testing, 24th informational 
supplement. Approved standard M100-S24. 
Clinical and Laboratory Standards Institute, 
Wayne, PA, 226 pp.
Dung, T. T., Haesebrouck, F., Tuấn, N. A., & 
Sorgeloos, P., 2010. Hiện trạng kháng thuốc 
kháng sinh trên vi khuẩn Edwardsiella 
ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra 
(Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng 
sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại 
học Cần Thơ, 15, 162-171.
Elmahdi, S., DaSilva, L. V., & Parveen, S., 2016. 
Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus 
and Vibrio vulnificus in various countries: A 
review. Food microbiology, 57, 128-134.
Han, J. E., Tang, K. F., Tran, L. H., & Lightner, 
D. V., 2015. Photorhabdus insect-related 
(Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio 
parahaemolyticus, the causative agent of acute 
hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of 
Bảng 3. IC
50
 và IC
90
 của 6 loại kháng sinh với các chủng V. parahaemolyticus
MIC
(µg/
ml)
% các chủng vi khuẩn bị ức chế
Norfloxacin Ciprofloxacin Doxycyclin Gentamicin Tetracycline Oxytetracycline
0,25 42,86 28,57 0 0 0 0
0,5 71,43 85,71 0 0 0 0
1 100 100 42,86 0 28,57 57,14
2 100 100 57,14 0 57,14 57,14
4 100 100 71,43 14,29 57,14 57,14
8 100 100 71,43 85,71 57,14 57,14
16 100 100 85,71 100 57,14 57,14
32 100 100 100 100 71,43 57,14
64 100 100 100 100 71,43 71,43
128 100 100 100 100 100 71,43
IC
50
0,32 0,36 1,46 9,33 1,75 x
IC
90
0,77 0,71 22,80 11,40 97,92 x
Ghi chú: x = không tính được
47TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
shrimp. Diseases of aquatic organisms, 113(1), 
33-40.
Lightner D.V., Redman C.R., Pantoja B.L., Noble 
L.M., Nunan, Loc Tran, 2013. Documentation 
of an Emerging Disease (Early Mortality 
Syndrome) in SE Asia & Mexico. OIE Reference 
Laboratory for Shrimp Diseases, Department of 
Veterinary Science & Microbiology, School of 
Animal and Comparative Biomedical Sciences.
Ruangpan, L., 2004. Minimal inhibitory 
concentration (MIC) test and determination of 
antimicrobial resistant bacteria. In Laboratory 
manual of standardized methods for antimicrobial 
sensitivity tests for bacteria isolated from 
aquatic animals and environment (pp. 31-55). 
Aquaculture Department, Southeast Asian 
Fisheries Development Center.
Vaseeharan, B., Ramasamy, P., Murugan, T. and 
Chen, J.C., 2005. In vitro susceptibility of 
antibiotics against Vibrio spp. and Aeromonas 
spp. isolated from Penaeus monodon 
hatcheries and ponds. International journal of 
antimicrobial agents, 26(4), pp.285-291.
Yano, Y., Hamano, K., Satomi, M., Tsutsui, I., Ban, 
M. and Aue-Umneoy, D., 2014. Prevalence and 
antimicrobial susceptibility of Vibrio species 
related to food safety isolated from shrimp 
cultured at inland ponds in Thailand. Food 
control, 38, pp.30-36.
Zorriehzahra, M. J., & Banaederakhshan, R., 
2015. Early mortality syndrome (EMS) as new 
emerging threat in shrimp industry. Adv. Anim. 
Vet. Sci, 3(2s), 64-72
48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
IN VITRO TRIALS OF ANTIBIOTICS ON THE ABILITY TO INHIBIT 
ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE PATHOGEN
Nguyen Diem Thu1*, Le Hong Phuoc1, Vo Hong Phuong1, Pham Vo Ngoc Anh1, 
Ma Tu Lan1, Tran Minh Trung1
ABSTRACT
Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus has resulted 
in significant economic losses in shrimp production in Vietnam. Previous studies reported that V. 
parahaemolyticus showed multiple-antibiotic resistance due to the misuse of antibiotics to control 
pathogenic infections in aquaculture. There is a lack of information on the doses of antibiotic usage 
for shrimp farmers in prevention of V. parahaemolyticus in the Mekong Delta, Vietnam. This study 
aimed to select the effective antibiotics by determining the minimum inhibitory concentration 
(MIC) and inhibitory concentrations at 50% (IC50) and inhibitory concentrations at 90% (IC90) of 
AHPND pathogenic V. parahaemolyticus isolates from AHPND shrimp samples in Vietnam. The 
study was carried out on 7 strains of AHPND pathogenic V. parahaemolyticus, including 5 trains 
from the South and 2 strains from the North of Vietnam, using 6 different antibiotics. The results 
showed that MIC values of these 7 strains were ≤ 0,25-1 mg/l for Norfloxacin, ≤ 0,25-1 mg/l for 
Ciprofloxacin, 1-32 mg/l for Doxycycline, 4-16 mg/l for Gentamicin, 1-128 mg/l for Tetracycline 
and 1 - ≥ 128 mg/l for Oxytetracycline. IC
50
 values
of Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycycline, 
Gentamicin and Tetracycline were 0.32; 0.36; 1.46; 9.33 and 1.75 µg/ml, respectively. IC
90 
values
were 0.76; 0.71; 22.80; 11.40 and 97.92 µg/ml, respectively.
Keywords: AHPND pathogenic Vibrio parahaemolyticus, antibiotics, MIC, IC
50
, IC90, farmed 
shrimp.
Người phản biện: TS. Lý Thị Thanh Loan
Ngày nhận bài: 26/11/2017
Ngày thông qua phản biện: 15/12/2017
Ngày duyệt đăng: 18/12/2017
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2.
* Email: thu_seven@yahoo.com