Nghiên cứu vi khuẩn không thuộc nhóm Vibrio có khả năng kết hợp với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan

h 22B), và sự xuất 
hiện của các thể vùi bắt màu eosin trong tế bào 
chất của các tế bào thuộc mô tạo máu (Hình 
23B). Ngoài ra, Tế bào E bị không bào hoá xuất 
hiện trong tất cả các nhóm thí nghiệm, bao gồm 
cả nhóm đối chứng âm. Tuy nhiên, ở nhóm đối 
chứng âm có cường độ và tỷ lệ thấp hơn (Hình 
24A và 24B). Ở nhóm chỉ ngâm 5HP ở 104 CFU/
ml, gan tụy của tôm hấp hối có dấu hiệu bong 
tróc các tế bào biểu mô của ống gan (hình 2C), 
tế bào E có dấu hiệu của bệnh AHPND (Hình 
24C). Tuy nhiên, cơ quan lymphô (Hình 22C) 
và mô tạo máu (Hình 23C) có dấu hiệu bình 
thường.
Hình 19. Mô bệnh học của nghiệm thức ngâm 105 CFU/ml5HP. Sự bong tróc của các tế bào biểu mô 
của ống gan được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X (A) và 40X (B).
38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 21. Mô học của gan tụy. (A) Gan tụy bình thường của tôm không gây nhiễm có nhiều tế bào B và 
tế bào R, (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có dấu tế bào biểu mô bị tan vỡ, và (C) Nhóm 5HP chỉ 
ra tế bào biểu mô bị bong tróc. Độ phóng đại 10X.
Hình 22. Mô học của cơ quan lymphô. (A) Lymphô bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm 
kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào trong tế bào kẻ (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra 
lymphô bình thường. Độ phóng đại 40X.
Hình 23. Mô học của mô tạo máu. (A) Mô tạo máu bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm 
kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều thể vùi bắt màu eosin trong tế bào chất (mũi tên), và (C) Nhóm 
5HP chỉ ra mô tạo máu bình thường. Hình A và B (độ phóng đại 40X); hình C (độ phóng đại 100X).
Hình 24. Mô học của vùng tế bào E. (A) Tế bào E ở nhóm không gây nhiễm có ít không bào (mũi tên). 
(B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra tế bào E 
bị bong tróc (mũi tên). Độ phóng đại 40X.
39TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
IV. THẢO LUẬN
Dữ liệu từ kết quả phân tích gen 16S rRNA 
của tôm bị nhiễm AHPND so với tôm khoẻ 
khám phá ra rằng khả năng vi khuẩn thuộc bộ 
Burkholdeirales có thể liên quan đến AHPND 
ở ô tôm nuôi ở Thái Lan (Prachumwat và 
ctv., 2012). Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào 
trước đây trình bày về các vi khuẩn thuộc bộ 
Burkholderiales gây bệnh trên tôm.
Nghiên cứu này là đầu tiên chỉ ra rằng vi 
khuẩn thuộc giống Delftia (bộ Burkholderiales) 
có thể gây chết tôm thẻ chân trắng. Kiểm tra sơ 
bộ với chủng Delftia acidovorans mua từ Viện 
CBS của Hà Lan khám phá ra rằng tỷ lệ chết của 
tôm có thể bị gây ra bởi vi khuẩn này với nồng 
độ tiêm 103CFU/3g tôm. Các tôm hấp hối sắp 
chết có dấu hiệu mô bệnh học khác với dấu hiệu 
mô bệnh học của AHPND như là sự tan vỡ của 
các tế bào biểu mô của ống gan tụy và sự không 
báo hoá các tế bào E. Ngoài ra, những đặc tính 
phụ không được mô tả ở tôm bị AHPND bao 
gồm sự có sự hiện những không bào bất thường 
trong gan tụy và cơ quan lymphô và các thể vùi 
trong tế bào chất bắt màu eosin hiện diện ở mô 
tạo máu. 
Bởi vì chủng D. acidovorans tham khảo 
được mua từ CBS, nó không thể phản ánh bản 
chất thực sự của Delftia giả định mà được chỉ ra 
trong phân tích PCR từ các trại tôm địa phương 
ở Thái Lan. Đối với chủng phân lập của tác 
nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND), 
môi trường TSA được sử dụng để phân lập và 
nó mang lại thành công trong phân lập Vibrio 
parahaemolytius gây AHPND (VP
AHPND
) ở Thái 
Lan (Joshi và ctv., 2014). Một đặc tính của V. 
parahaemolyticus là mọc rất mạnh khi được 
nuôi cấy trên TSA có bổ sung 1,5% NaCl. Sự 
phát triển nhanh chóng của V. parahaemolyticus 
có thể lấn át các loài khác. Điều này có thể dẫn 
đến thất bại trong việc phân lập các loài vi khuẩn 
liên quan khác như là các vi khuẩn đã khám phá 
từ phân tích gen 16S rRNA.
Để tránh vấn đề như vậy, việc sàn lọc các 
chủng Delftia từ các trại tôm được chia thành 
hai bước bao gồm sàn lọc bằng môi trường chọn 
lọc cho Delftia sp. và kết hợp với sàn lọc bằng 
PCR. Môi trường TSA không chứa NaCl có thể 
ức chế tốt đối với V. parahaemolyticus trong khi 
nó cho phép các vi khuẩn khác phát triển. Các vi 
khuẩn này được tiếp tục sàn lọc bằng PCR với 
các mồi đặc hiệu để khuyếch đại vùng IGS của 
D. acidovorans. Cường độ vạch sản phẩm PCR 
thu được từ các chủng phân lập khi được so sánh 
với đối chứng dương (D. acidovorans) là tương 
đối thấp. Giải thích cho điều này thì không rõ 
ràng nhưng có thể do có sự khác biệt một số 
nucleotide trong trình tự mồi nên số lượng bản 
sao của đoạn trình tự đích cho khuyếch đại PCR 
bị thấp.
Hai chủng phân lập Sh2-4 và So1-40 được 
chọn cho nghiên cứu sâu hơn. Theo phân tích 
hoá sinh bằng kít API 20 NE, hai chủng này 
được xác định là gần nhất với Pseudomonas 
luteola (kết quả không trình bày). Tuy nhiên, 
phân tích trình tự gen 16S rRNA chỉ ra rằng 
chủng phân lập Sh2-4 tương đồng vi khuẩn 
không được nuôi cấy, trong khi So1-40 thì 
tương đồng với chủng Bacillus. Kết quả này cho 
thấy sự hạn chế trong phân tích hoá sinh do số vi 
khuẩn cố định trong cơ sở dữ liệu của API. Theo 
so sánh trình tự một phần của gen 16S rRNA, 
sự giống nhau trình tự giữa D. acidovorans và 
Sh2-4 (92,6%) cao hơn sự giống nhau trình tự 
giữa D. acidovorans và So1-40 (78,9%). Kết 
quả này có thể đề nghị rằng Sh2-4 có thể là một 
thành viên của giống Delftia. Xây dựng cây 
phát sinh loài dựa vào trình tự một phần của gen 
16S rRNA chỉ ra rằng Sh2-4 nằm ở vị trí giữa 
nhánh Delftia và Ralstonia. Kết quả này gợi ý 
rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia thuộc họ 
Comamonadaceae, bộ Burkhodariales với chỉ 
số bootstrap 86%. Theo Felsenstein (1985) chỉ 
số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự quan hệ 
gần gũi giữa các thành viên của nhóm trong cây 
phân loài. Ngược lại, So1-40 nằm cùng nhánh 
với họ Bacillaceae. Vì vậy, So1-40 không được 
tiếp tục nghiên cứu sâu hơn.
Thí nghiệm sinh học bằng cách sử dụng 
chủng tham khảo D. acidovorans (RDA) 
cho kết quả chết tôm khác nhau ở các lần thí 
40 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
nghiệm. Hiện tượng này có thể được giải thích 
do trạng thái sức khoẻ của tôm ở các đợt thí 
nghiệm bởi vì chúng có thể khác nhau ở các lô 
tôm. Tỷ lệ chết ở tôm cũng xảy ra tương tự khi 
quan sát thí nghiệm cảm nhiễm của VP
AHPND 
(dữ 
liệu không trình bày). Ở thí nghiệm gây nhiễm 
kết hợp, tôm được tiêm Sh2-4 trước khi ngâm 
V. parahaemolyticus (5HP). Tôm chết nhanh 
hơn ở nhóm kết hợp khi so sánh với nhóm chỉ 
ngâm 5HP. Ở mức độ mô học, tôm hấp hối sắp 
chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không có biểu 
hiện của bong tróc cấp tính của các tế bào biểu 
mô của ống gan tụy như đặc tính của AHPND. 
Thay vào đó, mô tôm có biểu hiện tan vỡ các 
tế bào biểu mô cùng với những dấu hiệu mô 
bệnh học bao gồm xuất hiện nhiều không bào 
trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô và có 
sự hình thành các thể vùi bắt màu eosin trong 
tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu. 
Cùng với đó, kết quả này cho thấy rằng Sh2-4 
có thể nhiễm cộng hợp với V. parahaemolyticus 
(5HP). Điều này có thể dẫn đến một sự đánh giá 
thấp về tần suất xuất hiện AHPND trong việc 
chẩn đoán bệnh. Những quan sát gần đây cũng 
cho thấy rằng mẫu tôm từ các ao bị EMS thường 
thiếu các dấu hiệu bong tróc các tế bào trong 
ống gan tụy, nhưng thay vào đó nó có dấu hiệu 
tan vỡ của tế bào biểu mô.
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. Kết luận
Các kết quả cho thấy rằng loài Delftia có 
thể liên quan đến EMS ở tôm nuôi. Chúng tôi đã 
thiết lập được phương pháp PCR phát hiện đặc 
hiệu cho Delftia sp. và Delftia acidovorans dựa 
vào trình tự của vùng IGS (intergenic spacer). 
Chủng phân lập Delftia giả định mà sàn lọc 
từ các trại tôm địa phương được thực hiện thí 
nghiệm sinh học bằng phương pháp gây nhiễm 
kết hợp với VP
(AHPND)
 (5HP). Kết quả cho thấy 
rằng Delftia sp. có liên quan đến EMS/AHPND 
do nó có tác động bổ trợ đến tỷ lệ chết của tôm. 
Thời gian gây chết 50% (LT50) của nhóm kết 
hợp giữa Sh2-4 và 5HP là 1 ngày, trong khi LT50 
của 5HP là 4 ngày. Ở mức độ mô học, tôm hấp 
hối sắp chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không 
có biểu hiện của bong tróc cấp tính của các tế 
bào biểu mô của ống gan tụy như đặc tính của 
AHPND. Thay vào đó, mô tôm có biểu hiện tan 
vỡ các tế bào biểu mô cùng với những dấu hiệu 
mô bệnh học bao gồm xuất hiện nhiều không 
bào trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô và 
có sự hình thành các thể vùi bắt màu eosin trong 
tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu. 
5.2. Đề xuất
Để hiểu sâu hơn mối tương quan giữa dấu 
hiệu mô bệnh học riêng biệt và sự hiện diện của 
D. acidovorans ở trong các mô tương ứng, thì 
kỹ thuật lai in situ với mẫu dò phân tử đặc hiệu 
cho Delftia nên được thực hiện. Kế hoạch thí 
nghiệm trong tương lai nên thực hiện gây nhiễm 
kết hợp bằng phương pháp ngâm cả hai vi khuẩn 
để khẳng định có tác động bổ trợ hay không. 
Ngoài ra, để nghiên cứu đặc tính sâu hơn đối 
với Sh2-4, thì cần thiết phải giải trình tự toàn bộ 
chiều dài của gen 16S rRNA hoặc giải toàn bộ 
trình tự của bộ gen. 
LỜI CẢM ƠN
Đề tài này được sự hỗ trợ bởi học bổng 
Công nghệ Sinh học của Chính Phủ Việt Nam 
(Số 1254/QĐ-BGDĐT), Trung tâm Quốc gia 
Công nghệ Di truyền và Công nghệ Sinh học 
Thái Lan (BIOTECH Thái Lan), và Hội đồng 
Nghiên cứu Quốc gia Thái Lan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bell, T. A., & Lightner, D. V., 1998. Technique. 
In A Handbook of Normal Penaeid Shrimp 
Histology. Baton Rouge, Louisiana: World 
Aquaculture Society.
Chen, W.-M., Lin, Y.-S., Sheu, D.-S., Sheu, S.-
Y., 2011. Delftia litopenaei sp. nov., a poly-
β-hydroxybutyrate-accumulating bacterium 
isolated from a freshwater shrimp culture 
pond. International Journal of Systematic and 
Evolutionary Microbiology, 62(Pt 10), 2315–
21. 
FAO., 2013. Report of FAO/MARD Technical 
Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) 
or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome 
41TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
(AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/
VIE/3304). Hanoi, Viet Nam, 25–27 June 2013 
Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on 
phylogenies: an approach using the bootstrap. 
Evolution 39:783 – 791 . 
Flegel, T. W., 2012. Historic emergence, impact 
and current status of shrimp pathogens in Asia. 
Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), 
166–73. 
Joshi, J., Srisala, J., Truong, V. H., Chen, I.-
T., Nuangsaeng, B., Suthienkul, O.,  
Thitamadee, S., 2014. Variation in Vibrio 
parahaemolyticus isolates from a single Thai 
shrimp farm experiencing an outbreak of acute 
hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). 
Aquaculture, 428-429, 297–302. 
Leaño, E. M., Mohan, C., 2012. Early mortality 
syndrome threatens Asia’s shrimp farms. 
Global Aquaculture Advocate, July/Aug 
2012:38−39.
Lightner, D. V., Redman, R. M., Pantoja, C. R., 
Tang, K. F. J., Noble, B. L., Schofield, P., 
Mohney L. L., Nunan L. M., Navarro, S. A., 
2012. Historic emergence, impact and current 
status of shrimp pathogens in the Americas. 
Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), 
174–83. 
Mooney, A., 2012. An emerging shrimp disease 
in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? 
Available at: http:// aquatichealth.net/
issues/38607 (accessed 24 Feb 2012).
NACA-FAO., 2011. Network of Aquaculture 
Centers in Asia- Pacific — Food and Agriculture 
Organization of the United Nations) (2011). 
Quarterly Aquatic Animal Disease Report 
(Asia and Pacific Region), 2011/2, April-June 
2011. NACA, Bangkok, (April).
Prachumwat, A., Thitamadee, S., Sriurairatana, 
S., Chuchird, N., Limsuwan, C., Jantratit, 
W., Chaiyapechara, S., Flegel, T. W., 2012. 
Shotgun Sequencing of Bacteria from AHPNS 
A New Shrimp Disease Threat for Thailand. 
, Poster, National Institute for Aquaculture 
Biotechnology, Mahidol University, Bangkok, 
Thailand (Poster available for free download at 
www.enaca.org).
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., 1989. 
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 
Cold Spring Harbor, USA. 
Tran, L., Nunan, L., Redman, R. M., Mohney, L. 
L., Pantoja, C. R., Fitzsimmons, K., Lightner, 
D. V., 2013. Determination of the infectious 
nature of the agent of acute hepatopancreatic 
necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. 
Diseases of Aquatic Organisms, 105, 45–55.
42 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
STUDY OF NON-Vibrio BACTERIA AS POTENTIAL 
ASSOCIATES OF Vibrio parahaemolyticus IN CAUSING AHPND 
IN WHITE-LEG SHRIMP IN THAILAND
Trương HongViet1*, Ajaree Nilawongse2, Kallaya Sritunyalucksana3, 
Timothy W. Flegel2, Siripong Thitamadee2,3
ABSTRACT
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in penaeid shrimp has been reported in Thai-
land since 2012. Analysis of PCR amplified 16S rRNA gene fragments obtained from normal ver-
sus diseased shrimp samples revealed several bacterial candidates including Ralstonia sp., Delftia 
sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingmonas sp., Leifsonia sp., and Rhodococcus sp. were 
proportionally higher in EMS ponds than in normal ponds. In this study, we selected a reference 
Delftia acidovorans (NCCB 28024) (RDA) purchased from a culture collection to compare with 
two putative Delftia isolates (Sh2-4 and So1-40) screened from local Thai farms by culture and 
PCR screening. The 16S rRNA gene analysis revealed high similarity between the 16S rRNA gene 
sequence of Sh2-4 and that of D. acidovorans (92.6%) indicating that it may be a new Delftia spe-
cies. In contrast, So1-40 showed an alignment score of only 78.9%, suggesting that it was from a 
different genus. For co-challenge tests, shrimp were injection-challenged with Sh2-4 at concentra-
tions of 103 CFU per 3 gram shrimp followed by culture for 7 days before immersion challenge with 
Vibrio parahaemolyticus (VP
AHPND
) at 104 CFU/ml (101 lower than the normal LC50 quantity). The 
co-challenge test results suggested that this isolate exhibited increased the virulence of VP
AHPND
 but 
gave histopathologies different from AHPND (with sloughed signals of hepatopancreatic epithelial 
cells). These consisted of collapsed hepatopancreatic epithelial cells, vacuole formation in E cells 
of the hepatopancreas and lymphoid organ, and the presence of eosinophilic cytoplasmic inclusions 
in hematopoietic tissue.
Keywords: 16S rRNA, AHPND, EMS, Delftiaacidovorans, Vibrio parahaemolyticus
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 25/11/2016
Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016
Ngày duyệt đăng: 05/01/2017
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment &Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2
2 Faculty of Biotechnology - Mahidol University - Thailand
3 Faculty of Biotechnology - Mahidol University - Thailand
* Email: truonghongviet@yahoo.com