Khóa luận Nghiên cứu hưởng của một số nhân tố sinh thái đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật sinh màng nhầy được phân lập từ các mẫu đất dưới tán rừng thông nhựa (Pinus merkusii Jungh et de Vries) ở Hoành Bồ, Quảng Ninh

tây 200 gam 
Glucose 20 gam 
Nước 1000 ml 
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, 
cho vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, 
cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan 
đều,cho vào 10 bình tam loại 250 ml nút bông và quấn giấy ở miệng bình, hấp 
khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút (thí nghiệm được lặp lại 3 lần). 
+ Môi trường King’B không agar thành phần gồm: 
K2HPO4 0,15 gam 
MgSO4.7H2O 0,15 gam 
Peptone 20 gam 
Glycerol 10 ml 
H2O 1000 ml 
Sau khi hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút sau đó để các 
bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng các dụng cụ cần thiết và tiến 
hành trước ngọn lửa đèn cồn. 
+ Môi trường NB không agar thành phần gồm: 
Môi trường – thịt – pepton có thành phần: 
Nước thịt 1000ml 
Pepton 10g, pH=7; 
24 
Môi trường được hấp khử trùng 1 atm/30 phút. 
Lấy từng loại chủng có hiệu lực cao, dùng que cấy khử trùng lấy từng 
loại VK sinh màng nhầy cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 1 
vòng que cấy để đảm bảo lượng VK sinh màng nhầy đưa vào môi trường 
không quá ít. Nút bông và ghi rõ ký hiệu của từng loại. Cho các bình vào máy 
lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 280C với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các 
bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu trang trên môi trường PDA, đếm số lạc 
khuẩn hữu hiệu bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và 
Phạm Văn Ty, 1998); (Phạm Quang Thu và Nguyễn Thị Thúy Nga, 2007). 
3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của 
các chủng VSV sinh màng nhầy 
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ không khí đến sinh 
trưởng của hệ sợi nấm, khuẩn lạc VSV. 
Ẩm độ không khí cũng là một yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến 
sự sinh trưởng của VSV. Phương pháp được tiến hành theo Both.C pha NaCl 
với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo môi trường không khí có 
độ ẩm không khí (RH%) khác nhau cụ thể như sau : 
Công thức CT1 CT2 Ct3 CT4 CT5 
NaCl(g/100ml) 0 8 16 24 32 
RH% 100 95 90 85 80 
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm, mỗi bình 500ml. Cấy nấm vào 
chính giữa đĩa thạch PDA, mỗi bình hút ẩm đặt 10 đĩa thạch đã cấy nấm, đậy 
nắp lại để trong tối ở nhiệt độ phòng, đo kết quả sau 14 ngày. Thí nghiệm lặp 
lại 3 lần. Đo đường kính trug bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự 
phát triển của nấm gây bệnh. 
25 
Hình 3.1: Máy lắc nhân sinh khối 
3.4.3. Phương pháp xác định nhiệt độ sinh trưởng phù hợp : 
Được tiến hành với 8 công thức ở các thang nhiệt độ khác nhau (50C± 1, 
100C± 1, 150C± 1, 200C± 1, 250C± 1, 300C± 1, 350C± 1, 400C± 1) mỗi công 
thức 5 đĩa Petri, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cấy một lượng VK sinh màng 
nhầy như nhau (1/3 vòng que cấy) vào chính giữa các đĩa Petri chứa môi 
trường Asby hoặc để ở các nhiệt độ khác nhau.Theo dõi và ghi lại đường kính 
(đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình) phát triển của khuẩn lạc. Qua 
đó đánh giá mức độ phát triển của các chủng VSV ở các điều kiện khác nhau. 
26 
Hình 3.2: Kính hiển vi sử dụng trong phòng thí nghiệm 
27 
PHẦN 4 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
Dựa trên cơ sở các kết quả thí nghiệm trước kia của Trung tâm Nghiên 
cứu Bảo vệ rừng đã phân lập được 20 chủng Vi sinh vật sinh màng nhầy từ 
các mẫu đất thu thập từ rừng thông nhựa trên địa bàn huyện Hoành Bồ: 
Bảng 4.1: Các chủng VSV sinh màng nhầy đã được phân lập 
STT Mẫu Địa điểm thu mẫu 
Ký hiệu chủng VSV 
phân lập đươc 
1 HB16 Hoành Bồ - Quảng Ninh P16; P16.1 
2 HB17 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
3 HB18 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
4 HB19 Hoành Bồ - Quảng Ninh P19 
5 HB20 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
6 HB21 Hoành Bồ - Quảng Ninh P21 
7 HB22 Hoành Bồ - Quảng Ninh - 
8 HB40 Hoành Bồ - Quảng Ninh P40 
9 HB41 Hoành Bồ - Quảng Ninh P41 
10 HB42 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
11 HB43 Hoành Bồ - Quảng Ninh P43 
12 HB44 Hoành Bồ - Quảng Ninh P44 
13 HB45 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
14 HB46 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
15 HB47 Hoành Bồ - Quảng Ninh P47 
16 HB48 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
17 HB49 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
18 HB50 Hoành Bồ - Quảng Ninh _ 
19 HB51 Hoành Bồ - Quảng Ninh P51 
20 HB52 Hoành Bồ - Quảng Ninh P52 
Từ 20 mẫu đất thu thập trên địa bàn huyện Hoành Bồ - Quảng Ninh, 
tiến hành phân lập được 11 chủng Vi sinh vật sinh màng nhầy. 
28 
P16 P16.1 P19 
P21 P41 P44 
Hình 4.1: Một số chủng VSV sinh màng nhầy 
4.1. Kết quả xác định độ nhớt và hàm lượng Polysaccaride của các chủng 
VSV sinh màng nhầy 
Căn cứ vào phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh VSV sinh màng 
nhầy trong phòng thí nghiệm đã tiến hành sử dụng 11 chủng VSV sinh màng 
nhầy để đánh giá độ nhớt và hàm lượng polysaccarits tạo được thành, kết quả 
được trình bày qua bảng 4.2. 
Bảng 4.2: Độ nhớt của 11 chủng VSV sinh màng nhầy 
STT Ký hiệu mẫu Độ nhớt (centipoise, cP) 
1 P40 9 
2 P41 7 
3 P43 8 
4 P47 5 
5 P51 2 
6 P52 8 
7 P16 3 
8 P16.1 4 
9 P19 2 
10 P21 1 
11 P44 3 
29 
Từ kết quả thí nghiệm và bảng 4.2 ta có biểu đồ hình 4.2 
Hình 4.2. Biểu đồ khả năng tạo độ nhớt của các chủng VSV 
sinh màng nhầy 
Hình 4.3. Khả năng sinh polysaccarit của chủng P16.1 và P51 
Theo bảng số liệu 4.2 và biểu đồ hình 4.2 ta thấy cả 11chủng đều có 
khả năng tạo độ nhớt, trong đó: 
Chủng P40 sản sinh ra lượng Polysaccarrit lớn nhất, đạt 9 centipoise. 
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
P40 P41 P43 P47 P51 P52 P16 P16.1 P19 P21 P44
Độ nhớt (centipoise, cP)
Độ nhớt (centipoise, cP)
30 
Chủng P21 sản sinh ra lượng Polysaccarrit ít nhất, đạt 1 centipoise. 
Hai chủng P43 và P52 đều sản sinh được lượng Polysaccarrit là 8 centipoise. 
Các chủng còn lại sản sinh lượng Polysaccarrit ở mức độ trung bình 3-5 centipose. 
P.43 P.52 
P.40 P.51 
Hình 4.4: Các chủng vi khuẩn sinh màng nhầy tiến hành nghiên cứu 
4.2. Kết quả xác đinh môi trường nhân sinh khối phù hợp 
Thí nghiệm chỉ thực hiện đối với 3 chủng VSV có khả năng sinh màng 
nhày có chỉ số độ nhớt cao nhất: P.40; P.43; P.52. 
Mỗi chủng vi khuẩn có môi trường dinh dưỡng phù hợp khác nhau được 
thể hiện ở khả năng sinh trưởng (mật độ lạc khuẩn hữu hiệu trên 1 ml dung 
dịch nuôi cấy là lớn nhất). Chính vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường 
dinh dưỡng đến mật độ khuẩn lạc giúp chúng ta biết được trên môi trường nào 
31 
vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất, từ đó xác định được 
môi trường nhân sinh tốt nhất. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 môi trường 
dinh dưỡng khác nhau, kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.3. 
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến môi trường mật độ 
vi khuấn sinh màng nhầy 
TT Môi trường nhân sinh khối 
Mật độ tế bào hữu hiệu của các 
chủng vi khuẩn sinh màng nhầy 
(CFU/ml) 
P.43 P.40 P.52 
1 Môi trường PD 3.9 x 109 5.4 x 109 6.7 x 109 
2 Môi trường Hansen 5.7 x 109 7.2 x 109 5.2 x 109 
3 Môi trường King’ B không có agar 5.3x 109 5.9 x 109 5.5 x 109 
Qua thí nghiệm đã tiến hành ở 3 MT khác nhau và kết quả ở bảng 4.3 ta 
có biểu đồ hình 4.3. 
Hình 4.5. Biều đồ mức độ phát triển của các chủng vi sinh vật 
ở các môi trường nhân sinh khối khác nhau 
0
1
2
3
4
5
6
7
8
P.43 P.40 P.52
MT PD
MT Hansen
MT King' B
32 
Qua bảng số liệu bảng 4.3 và hình 4.5 cho thấy các chủng khuẩn sinh 
màng nhầy này đều có khả năng sinh trưởng ở 3 môi trường dinh dưỡng. 
Ngoài ra bảng số liệu cho thấy có sự chênh lệch về mật độ khuẩn lạc của 
cácchủng khi được nuôi cấy ở các môi trường khác nhau: 
- Đối với 2 chủng P40 và P43 mật độ tế bào cao nhất khi nuôi cấy trong 
môi trường Hansen, mật độ tế bào đạt tới 5.7*109 và 7.2*109 CFU/ml. 
- Chủng P52 ở môi trường PD cho thấy mật độ tế bào đạt cao nhất 
6.7*109 CFU/ml. 
Kết luận: Qua kết quả thí nghiệm đã tiến hành và số liệu ở bảng 4.3 
cho thấy MT Hansen là MT tốt nhất để nuôi cấy chủng P40 và P43, còn MT 
PD là môi trường thích hợp để nuôi cấy chủng P52. 
MT King’B không agar MT Hansen MT PD 
Hình 4.6. Mật độ khuẩn lạc của chủng P43 ở 3 môi trường nuôi cấy 
4.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các 
chủng VSV sinh màng nhầy 
Sự phù hợp của nhiệt độ đến từng chủng VSV biểu hiện ở khả năng 
sinh trưởng của chúng (mật độ khuẩn lạc hữu hiệu trên 1ml dung dịch nuôi 
cấy là lớn nhất). Ở mỗi loài vi khuẩn thì sự phù hợp với các nhiệt độ là khác 
nhau để đảm bảo được mật độ khuẩn lạc hữu hiệu tối ưu thí nghiệm được thực 
33 
hiện trên 8 chế độ nhiệt độ khác nhau: 50C, 100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 
350C, 400C kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.4. 
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ tế bào 
vi khuẩn sinh màng nhầy 
TT 
Chủng 
VSV 
Mật độ tế bào hữu hiệu của các chủng VSV (cfu/ml) 
5oC 10oC 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 
1 P43 6,3.104 7,4.105 7,1.107 9,7.108 3,8.109 2,5.109 8,2.107 8,5.107 
2 P40 6,7.104 6,8.105 6,8.107 1,9.109 4,1.109 3,5.109 7,9.107 6,8.107 
3 P52 6,1.104 5,5.105 5,4.107 8,7.108 2,3.109 1,1.109 8,3.107 9,7.107 
Thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy phù hợp với các chủng vi khuẩn 
sinh màng nhầy được thực hiện ở 8 thang nhiệt độ từ 5 đến 40 độ C. Qua bảng 
số liệu ta có thể thấy rằng các chủng vi sinh vật đều có thể sinh trưởng được 
trong khoảng nhiệt độ từ 5 đến 400C. Nhưng khi ở điều kiện nhiệt độ 5 và 
100C các chủng VSV phát triển kém, mật dộ tế bào chỉ đạt được 105CFU/ml. 
Khi thí nghiệm tăng nhiệt độ từ 10 đến 250C mật độ tế bào ở từng thang 
nhiệt độ cũng tăng lên. 
Mật độ tế bào đạt cao nhất khi nuôi cấy ở 25oC. 
Khi tăng nhiệt độ lên trên 250C mật độ tế bào có trong môi trường nuôi 
cấy bắt đầu giảm. 
Nhìn chung, 3 chủng VSV đều có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 
đến 40oC nhưng qua bảng 4.4 ta thấy mức nhiệt độ mà cả 3 chủng VSV sinh 
trưởng tốt nhất là 25oC cho thấy mức nhiệt độ 25oC là thích hợp nhất để nuôi 
cấy 3 chủng VSV. 
34 
5 oC 10 oC 15 oC 20 oC 
25 oC 30 oC 35 oC 40 oC 
Hình 4.7. Mật độ khuẩn lạc của chủng P40 ở 8 thang nhiệt độ khác nhau 
4.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các 
chủng VSV sinh màng nhầy 
Qua thí nghiệm tiến hành để đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự 
sinh trưởng của 3 chủng VSV P40, P43 và P52 đã thực hiện với 5 mức ẩm độ 
khác nhau từ 60% đến 100% và kết quả được trình bày tại bảng 4.5. 
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của ẩm độ môi trường đến đường kính khuẩn lạc 
vi khuẩn sinh màng nhầy 
STT KH Mẫu 
Ẩm độ (mm) 
60% 70% 80% 90% 100% 
1 P40 15.2 19 22.5 17.5 16 
2 P43 13.5 15.5 18 14.5 12.5 
3 P52 9.5 10.5 12.5 11.5 10 
35 
Từ bảng 4.5 ta có biểu đồ hình 4.8. 
Hinh 4.8. Biểu đồ ảnh hưởng của độ ẩm nuôi cấy đến đường kính 
khuẩn lạc vi sinh vật sinh màng nhầy sau 10 ngày nuôi cấy 
Qua bảng số liệu 4.5 và biểu đồ 4.5, sau 10 ngày nuôi cấy, các chủng vi sinh 
vật sinh màng nhầy sinh trưởng và phát triển được ở cả 5 thang ẩm độ thí nghiệm. 
Chủng P.40 phát triển mạnh nhất so với 2 chủng VSV còn lại, đạt 
đường kính khuẩn lạc lớn nhất 22.5 mm. 
Cả 3 chủng VSV đều đạt đường kính lớn nhất ở điều kiện độ ẩm 80%. 
Khi độ ẩm tăng từ 60 đến 80%, đường kính khuẩn lạc trên môi trường 
nuôi cấy cũng tăng theo. 
Độ ẩm tăng từ 80% đến 100%, đường kính khuẩn lạc giảm dần. 
0
5
10
15
20
25
P40 P43 P52
60%
70%
80%
90%
100%
36 
60% 70% 80% 
90% 100% 
Hình 4.9: VSV P.43 ở các ẩm độ khác nhau sau 5 ngày nuôi cấy 
Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, chủng P43 sinh trưởng và 
phát triển được ở cả 5 thang ẩm độ nghiên cứu. 
Ở điều kiên ẩm độ 80%, khuẩn lạc của chủng P.43 có đường kính lớn 
nhất, đạt 18 mm. 
Ở điều kiện ẩm độ 60%, khuẩn lạc có đường kính nhỏ nhất, đạt 13.5 
mm. Khi ẩm độ tăng từ 60 đến 80%, đường kính khuẩn lạc tăng dần. Đường 
kính khuẩn lạc giảm khi ẩm độ tăng từ 80 đến 100%. 
Qua kết quả phân tích cho ta thấy, cả 3 chủng P40, P43 và P52 đều có 
thể sinh trưởng ở các mức ẩm độ từ 60 đến 100% nhưng qua bảng 4.5 và biểu 
đồ hình 4.8 cho thấy mức ẩm độ thích hợp để nuôi cấy của cả 3 chủng là mức 
ẩm độ 80%. 
37 
PHẦN 5 
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 
5.1. Kết luận 
- Khóa luận đã bước đầu xác định được 3 chủng P40, P43, P52 có khả 
năng sản sinh ra lượng Polysaccarrit lớn nhất, đạt 8 centipoise trở lên. 
- Tiếp tục đánh giá sinh trưởng và phát triển của 3 chủng Vi sinh vật 
sinh màng nhầy ở các môi trường nuôi cấy khác nhau, các điều kiện nhiệt độ 
và ẩm độ khác nhau, có được kết quả: 
+ Chủng P40 khi tiến hành lắc nhân sinh khối đạt mật độ cao nhất ở 
môi trường Hansen, mật độ đạt được 7,2 x 109CFU/ml, nhiệt độ nuôi cấy tốt 
nhất ở khoảng 25oC. 
+ Chủng P43 nhân sinh khối đạt mật độ cao nhất ở môi trường Hansen 
nhiệt độ nuôi cấy khoảng 25oC,mật độ đạt được 5.7 x 109 CFU/ml. 
+ Chủng P52 nhân sinh khối đạt mật độ cao nhất ở môi trường PD đạt 
6.7 x 109, nhiệt độ nuôi cấy tốt nhất khoảng 25oC. 
+ Cả 3 chủng P40, P43, P52 đều sinh trưởng tốt nhất ở ẩm độ 80%. 
5.2. Kiến nghị 
Tiếp túc nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện sinh trưởng: thời gian 
nhân sinh khối, tốc độ lắc, pH môi trường của 3 chủng VSV, tiến hành định 
danh xác định mức độ an toàn sinh học. 
38 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
I. Tài liệu tiếng Việt 
1. Nguyễn Kiều Băng Tâm (2009), Chế phẩm nấm men Lipomyces sinh màng 
nhầy nhằm giữ ẩm và cải thiện một số tính chất đất dốc tại huyện Mê 
Linh, tỉnh Vĩnh Phúc, Luận án Tiến sỹ trường Đại học Khoa học Tự 
nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội 
2. Tống Kim Thuần, Đặng Thị Mai Anh, Đỗ Thị Thu Phương (2005), Nghiên 
cứu sản xuất chế phẩm giữ ẩm vi sinh vật giữ ẩm Lipomycin starkeyi 
PT7.1 trên cơ chất bột sắn. Những vấn đề cơ bản trong nghiên cứu sinh 
học sự sống. Báo cáo khoa học tại Hội nghị Toàn quốc lần thứ 5. Đại 
học Y Hà Nội 3/11/2005 
3. Nguyễn Thị Thúy Nga (2010). “Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả 
năng phân giải xenlulo hiệu lực cao, phù hợp với điều kiện đất bạc màu 
và đặc điểm sinh học của chúng để sản xuất phân vi sinh cho cây lâm 
nghiệp”. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt 
Nam số 4/2010. 
II. Tài liệu tiếng Anh 
4. Lu WJ., Wang HT., Nie YF., Wang ZC., Huang HY., Qiu XY., Chen JC. 
(2005), “Effect of inoculating flower stalks and vegetable waste, Awith 
ligno- cellulolytic microorganisms on the composting process”, Journal 
of Environmental Science and Health B.39 (5-6), pp.871-875 
5. Hsi-Jien Chen, Han-Ja Chang, Chahhao Fan, Wen-Hsin Chen, Meng 
(2011). “Screening, isolation and characterization of xenlulo 
biotransformation bacteria from specific soils”, International 
Conference on Environment and Industrial Innovation IPCBEE vol.12 
(2011) IACSIT Press, Singapore. 
39 
6. Lamot E.L and Voets J.P. (1978), “Microbial bio - degradation of 
cellophane”, Zeitschrift fur allgemeine.18, pp.183-188. 
7. Bashir Ahmad, Sahar Nigar, S. Sadaf Ali Shah, Shumaila Bashir, Javid 
Ali, Saeeda Yousaf an Javid Abbas Bangash (2013), “Isolation and 
Identification of Xenlulo Degrading Bacteria from Municipal Waste 
and their Scereening for potenital Antimicrobitial Activity”, World 
applied sciences Journal 27 (11): 1420-1426, 2013 
PHỤ LỤC 
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM