Khảo sát tỷ lệ nhiễm và phân tích gen SSU rRNA của vi bào tử trùng gây bệnh trên tôm nuôi nước lợ

Nguyễn Văn Duy2
TÓM TẮT
Tổng	số	238	mẫu	tôm,	trong	đó	có	52	mẫu	tôm	giống	(post-larva)	và	186	mẫu	tôm	thương	phẩm	
đã được	thu	thập	từ	các	ao	nuôi	tôm	nghi	mắc	bệnh	do	vi	bào	tử	trùng	tại	ba	tỉnh	Ninh	Thuận,	Kiên	
Giang	và	Bạc	Liêu	để	sử	dụng	trong	nghiên	cứu	này.	Áp	dụng	phương	pháp	PCR	với	cặp	mồi	đặc 
hiệu	EHP-510F/	EHP-510R	để	xác	định	tỷ	lệ	nhiễm	vi	bào	tử	trùng	EHP	từ	số	lượng	mẫu	nêu	trên.	
Kết	quả	PCR	cho	thấy	tỷ	lệ	tôm	bị	nhiễm	bệnh	ở	3	tỉnh	Ninh	Thuận,	Kiên	Giang	và	Bạc	Liêu	lần	lượt	
là:	19,44%;	1,16%	và	2,27%;	trong	đó	tỷ	lệ	nhiễm	bệnh	của	tôm	thương	phẩm	là	cao	hơn	so	với	tôm	
giống	.	Kết	quả	phân	tích	trình	tự	nucleotide	SSU	rRNA	từ	23	mẫu	tôm	cho	thấy	tất	cả	vi	bào	tử	trùng	
phân	lập	được đều	thuộc	loài	Enterocytozoon hepatopenaei.	Kết	quả	xây	dựng	cây	phân	loại	cho	
thấy	loài	vi	bào	tử	trùng	này	ở	Việt	Nam	có	quan	hệ	gần	với	loài	vi	bào	tử	Nucleospora salmonis, 
Agmasoma penae	gây	bệnh	trên	cá.
Từ khóa:	vi	bào	tử	trùng,	bệnh	trên	tôm,	tôm	nước	lợ,	EHP
Infection rate and SSU rRNA gene analysis of microsporidium caused 
disease in brackishwater shrimp
Vu Khac Hung, Nguyen Thi Thu Giang,
 Trinh Thi Thu Hang, Nguyen Xuan Truong, Nguyen Van Duy
SUMMARY
A total of 238 shrimps (52 post-larvae and 186 commodity shrimps) were collected from the 
shrimp farms, suspecting infection with microsporidium in Ninh Thuan, Kien Giang and Bac 
Lieu provinces as materials for this study. Total DNA from these samples were extracted to 
identify the EHP infection rate by PCR method using specific primers EHP-510F/ EHP-510R. 
The PCR result showed that the EHP infection rate of shrimps in Ninh Thuan, Kien Giang and 
Bac Lieu provinces was 19.44%; 1.16%; 2.27%, respectively; of which, the infection rate of the 
commodity shrimps was higher than that of the post-larvae. The result of analyzing 23 SSU 
rRNA sequences from 23 shrimp samples indicated that the isolated microsporidium strains in 
Viet Nam belonged to Enterocytozoon hepatopenaei species, and this species related closely 
with Nucleospora salmonis, Agmasoma penae, which caused diseases in fish.
Keywords: microsporidian, shrimp disease, brackish water shrimp, EHP. 
1.	Phân	viện	Thú	y	miền	Trung
2.	Đại	học	Nha	Trang
I. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Bệnh	 do	 vi	 bào	 tử	 trùng	 là	 một	 bệnh	 rất	
phổ	 biến	 và	 nguy	 hiểm	 cho	 ngành	 nuôi	 tôm	
(Karthikeyan	 Kesavan	 và	 cs.,	 2016).	 Theo	
Perschbacher	 (1995);	 Tourtip	 và	 cs.,	 (2009),	 ở	
Đông	Nam	Á,	tỷ	lệ	tôm	chết	do	nhiễm	vi	bào	tử
trùng	 Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)	 gia	
tăng	đáng	kể	trong	những	năm	gần	đây.
Hiệp	hội	chế	biến	và	xuất	khẩu	thủy	sản	Việt	
Nam	(VASEP)	họp	ngày	10/2/2015	tại	Cần	Thơ	
đã	nêu	ra	tình	trạng	tôm	nuôi	bị	chậm	lớn	diễn	ra	
tại	nhiều	vùng	nuôi	 tôm	Việt	Nam	từ	giữa	năm	
2014,	gây	 thiệt	hại	đáng	kể.	Tại	 cuộc	họp,	 tiến	
72
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ 1 - 2018
sĩ	Trần	Hữu	Lộc	đã	nhận	định:	tôm	chậm	lớn	do	
nhiều	nguyên	nhân,	trong	đó	cần	kể	đến	là	nhiễm	
vi	bào	tử	trùng	EHP.
Cho	đến	hiện	nay,	các	nghiên	cứu	chủ	yếu	tập	
trung	vào	việc	phát	hiện	bệnh	do	vi	bào	tử	trùng	
bằng	phương	pháp	mô	học	và	chưa	có	một	nghiên	
cứu	cụ	thể	nào	xác	định	tỷ	lệ	cảm	nhiễm	vi	bào	
tử	trùng	cũng	như	thành	phần	loài	vi	bào	tử	trùng	
trên	tôm	nuôi	tại	Việt	Nam.
Trước	 tình	 hình	 trên,	 chúng	 tôi	 thực	 hiện	
nghiên	cứu	“Khảo	 sát	 tỷ	 lệ	nhiễm	và	phân	 tích	
gen	SSU	rRNA	của	vi	bào	tử	trùng	gây	bệnh	trên	
tôm	nuôi	nước	lợ”.	Mục	tiêu	của	nghiên	cứu	là	
nhằm	xác	định	 tỷ	 lệ	nhiễm	vi	bào	 tử	 trùng	của	
tôm	 nuôi	 tại	 ba	 tỉnh	 Ninh	 Thuận,	 Kiên	 Giang,	
Bạc	Liêu;	đồng	thời	xác	định	loài	vi	bào	tử	trùng	
gây	bệnh	trên	tôm.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU
2.1. Thu mẫu tôm 
238	mẫu	 tôm	 có	 dấu	 hiệu	 còi	 cọc	 được	 thu	
thập	 từ	 các	 ao	nuôi	 nghi	 ngờ	nhiễm	bệnh	ở	 các	
tỉnh	Ninh	Thuận,	Kiên	Giang	và	Bạc	Liêu	từ	tháng	
4	–	9/2016.	Mẫu	được	cho	vào	hộp	nhựa	sạch,	trữ	
lạnh	và	được	chuyển	trực	tiếp	về	phòng	thí	nghiệm	
Công	nghệ	sinh	học,	Phân	viện	thú	y	miền	Trung	–	
Nha	Trang.	Mẫu	được	xử	lý	tách	chiết	DNA	ngay	
hoặc	cố	định	trong	cồn	ethanol	96%.
Đồng	thời	với	việc	lấy	mẫu	tôm,	chúng	tôi	thu	
mẫu	nước	để	đo	hàm	lượng	muối	trung	bình	tại	
từng	ao	nuôi.	Nồng	độ	muối	được	đo	bằng	máy	
đo	độ	mặn	ATAGO	ES-421.	
2.2. Phương pháp chiết tách DNA tổng 
số 
DNA	từ	những	mẫu	gan	tụy	đã	qua	xử	lý	được	
tách	chiết	bằng	bộ	kit	QIAGEN	Dneasy	Blood	&	
Tissue	Kit	theo	hướng	dẫn	của	nhà	sản	xuất.
DNA	tổng	số	sau	khi	tách	chiết	được	kiểm	tra	
bằng	phương	pháp	điện	di	trong	đệm	TAE	dưới	
nguồn	điện	130V,	DNA	sau	khi	tách	chiết	được	
bảo	 quản	 -20ºC	 để	 sử	 dụng	 cho	 các	 phản	 ứng	
PCR	sau	đó.
2.3. Phương pháp PCR xác định tỷ lệ nhiễm vi 
bào tử trùng
Cặp	mồi	được	sử	dụng	cho	phản	ứng	PCR	là	EHP-
510F	 	 (5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT-3’)	
EHP-510R	 (5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCC-
GA-	3’)	theo	mô	tả	của	Tang	và	cs,	2015.	Hỗn	hợp	
phản	ứng	PCR	bao	gồm:	12,5µl	GoTaq	colorless	
master	mix	2x	(Promega);	9,5µl	nước;	0,5µl	mồi,	
2µl	DNA.	Chu	trình	nhiệt	được	thực	hiện	trong	
35	chu	kỳ	bao	gồm:	94ºC:	30	giây,	60ºC:	30	giây, 
72ºC:	90	giây.	Sản	phẩm	của	phản	ứng	được	điện	
di	trên	gel	agarose	1,5%.
Sản	phẩm	PCR	được	tách	chiết	và	 tinh	sạch	
từ	 gel	 bằng	 bộ	 kit	 sinh	 phẩm	 QIAquick	 Gel	
Extraction	Kit	theo	hướng	dẫn	của	nhà	sản	xuất.	
Sản	phẩm	PCR	được	gửi	đi	giải	trình	tự	tại	công	
ty	Macrogen	Hàn	Quốc.	Trình	tự	DNA	được	xử	
lý	kết	quả	bằng	phần	mềm	Mega	6	và	dữ	liệu	ở	
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử 
trùng trên tôm
Hình 1. Kết quả điện di mẫu tôm 
bị nhiễm vi bào tử trùng EHP
M: Marker kích thước 100bp
P: Đối chứng dương
NTC (Non-template control): Đối chứng âm
1 -6: Mẫu vi bào tử trùng được tách từ gan tụy tôm
Phản	ứng	PCR	cho	band	có	kích	thước	khoảng	
500bp,	là	kích	thước	mong	muốn	của	Tang	và	cs.,	
(2015).	Nhóm	 tác	giả	này	đã	phát	 triển	kỹ	 thuật	
73
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ 1 - 2018
Bảng 1. Tỷ lệ mẫu dương tính với phản ứng PCR theo địa phương
Tỉnh Số mẫu Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
Ninh Thuận 108 21 19,44
Kiên Giang 86 1 1,16
Bạc Liêu 44 1 2,27
Tổng mẫu 238 23 9,66
PCR	với	cặp	mồi	đặc	hiệu	EHP-510F/	EHP-510R	
để	 phát	 hiện	 EHP	 trên	 tôm	 nuôi	 và	 đã	 khuếch	
đại	 được	 đoạn	 gen	 có	 kích	 thước	 510bp.	 Cặp	
mồi	 trên	được	xây	dựng	đặc	hiệu	 riêng	cho	 loài	
Enterocytozoon hepatopenaei,	 chỉ	 nhân	 lên	 với	
DNA	 của	 loài	 này	 và	 phân	 biệt	 rõ	 ràng	 (không	
nhân	lên)	với	DNA	của	loài	có	quan	hệ	gần	nhất	
là	Enterocytozoon bieneusi. Mặt	khác,	 nhóm	 tác	
giả	cũng	đã	chứng	minh	rằng	cặp	mồi	này	cũng	
không	nhân	 lên	với	các	 loài	vi	bào	 tử	giống	với	
Pleistophora	có	liên	quan	đến	bệnh	tôm	bông	gòn.	
Kết	quả	điện	di	cho	thấy	23/238	mẫu	dương	
tính,	trong	đó	có	21	mẫu	được	thu	từ	Ninh	Thuận	
(chiếm	19,44%),	1	mẫu	ở	Kiên	Giang	(1,16%)	và	
1	mẫu	ở	Bạc	Liêu	(2,27%)	(bảng	1).	
Bảng 2. Tỷ lệ mẫu dương tính với phản ứng PCR theo cỡ tôm
Loại tôm Số mẫu Số mẫu dương tính Tỷ lệ %
Tôm post 52 3 5,77
Tôm thương phẩm 186 20 10,75
Tổng mẫu 238 23 9,6
Nguyễn	Thị	Hà	(2010)	trước	đây	cho	thấy	tỷ	
lệ	 nhiễm	 vi	 bào	 tử	 trùng	 trên	 tôm	 là	 78,78%	 -	
85,45%;	tỷ	lệ	này	khá	cao	vì	các	mẫu	để	kiểm	tra	
đều	lấy	từ	tôm	được	xác	định	là	đã	nhiễm	bệnh,	
có	dấu	hiệu	bệnh	 lý	 rõ	 ràng.	Trong	nghiên	cứu	
của	Bùi	Quang	Tề	(2010),	kết	quả	phân	tích	mẫu	
gan	tụy	tôm	nuôi	thương	phẩm	trong	các	ao	đang	
bị	bệnh	bằng	phương	pháp	mô	bệnh	học	cho	tỷ	lệ	
nhiễm	vi	bào	tử	(Enterocytozoon sp.)	là	92,77%.	
Kết	 quả	 nghiên	 cứu	 của	 chúng	 tôi	 không	 cao,	
nguyên	 nhân	do	mẫu	 tôm	được	 lấy	 ngẫu	 nhiên	
từ	các	ao	hồ	nuôi	 tôm	bình	 thường.	Tuy	nhiên,	
cũng	theo	tác	giả	Bùi	Quang	Tề	(2010),	tỷ	lệ	cảm	
nhiễm	 trong	 các	 ao	 tôm	 khỏe	 (bình	 thường)	 là	
22%.	Một	nghiên	cứu	khác	của	Prasertsri	(2009)	
xác	định	được	tỷ	lệ	nhiễm	vi	bào	tử	là	25	–	28%	
đối	với	tôm	thả	ao	60	ngày.	
Khi	xem	xét	 tỷ	 lệ	dương	 tính	giữa	các	 tỉnh,	
chúng	tôi	nhận	thấy	ở	Ninh	Thuận	có	tỷ	lệ	nhiễm	
vi	bào	tử	cao	hơn	so	với	hai	tỉnh	Bạc	Liêu	và	Kiên	
Giang.	Điều	này	có	thể	là	do	sự	thay	đổi	nồng	độ	
muối	trong	nước	tại	ao	nuôi.	Để	khẳng	định	nhận	
định	trên,	chúng	tôi	đã	tiến	hành	đo	nồng	độ	muối	
trung	bình	tại	ao	nuôi	của	ba	tỉnh.	Tại	thời	điểm	
lấy	mẫu,	chúng	tôi	nhận	thấy	các	ao	nuôi	ở	Ninh	
Thuận	có	nồng	độ	muối	trung	bình	là	2,28%,	cao	
hơn	so	với	các	ao	nuôi	ở	Kiên	Giang	(1,78%)	và	
Bạc	Liêu	(1,82%).	Năm	2015,	khi	nghiên	cứu	về	
các	yếu	tố	môi	trường	làm	phát	sinh	bệnh	do	vi	
bào	tử,	John	Sackton	đã	khẳng	định	độ	mặn	thấp	
tạo	thuận	lợi	gây	ít	tác	động	và	tăng	trưởng	của	
tôm	 tốt	 hơn;	độ	mặn	cao	xuất	hiện	 tương	quan	
với	tăng	trưởng	kém	và	tác	động	lớn	hơn.	Ngoài	
ra,	vi	bào	tử	trùng	lây	lan	trong	nước,	và	gần	như	
không	thể	phá	hủy, do	đó	trong	quá	trình	nuôi,	khi	
nhiều	ao	nuôi	trong	một	khu	vực	bị	nhiễm	bệnh,	
các	đường	dẫn	nước	sẽ	mang	bào	tử	đưa	tới	các	
ao,	các	 trại	giống	và	 tôm	bố	mẹ	chưa	bị	nhiễm	
bệnh	khác. 
74
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ 1 - 2018
Theo	kết	quả	 tỷ	 lệ	nhiễm	bệnh	 theo	giai	đoạn	
phát	 triển	 tôm,	 chúng	 tôi	 nhận	 thấy	 tôm	 thương	
phẩm	có	 tỷ	 lệ	 nhiễm	vi	 bào	 tử	 trùng	 cao	hơn	 so	
với	 tôm	 post	 (10,75%	 và	 5,77%).	 Theo	 nghiên	
cứu	của	Bùi	Quang	Tề	và	cs.,	(2010),	tỷ	lệ	nhiễm	
của	 tôm	 post	 thu	 được	 là	 19,44%,	 thấp	 hơn	 so	
với	 tôm	 thương	 phẩm	 92,77%.	Ngoài	 ra,	 Chalor	
Limsuwan	và	cs.,	 (2008)	khi	nghiên	cứu	 tôm	 thẻ	
chân	trắng (Litopenaeus vannamei) tại	tỉnh	Prachup	
Khiri	Khan	đã	kết	luận	tôm	đã	bị	nhiễm	kí	sinh	trùng	
vi	bào	tử	lúc	20	ngày	tuổi	sau	khi	thả	giống	vào	ao.	
Kết	quả	giải	trình	tự	gen	các	mẫu	dương	tính	
với	phản	ứng	PCR.
Sau	khi	được	xác	định	dương	tính	với	vi	bào	
tử	trùng	bằng	phản	ứng	PCR,	chúng	tôi	gửi	tất	cả	
mẫu	đi	giải	trình	tự	ở	công	ty	Macrogen	Inc.,	Hàn	
Quốc.	Sản	phẩm	PCR	của	23	chủng	sau	khi	gửi	đi	
giải	trình	tự	được	sử	dụng	chương	trình	BLAST	N	
(Nucleotide	Basic	Local	Alignment	Search	Tool)	
để	so	sánh	với	 trình	 tự	18S	rRNA	của	vi	bào	 tử	
trùng	EHP	có	trong	ngân	hàng	dữ	liệu	của	NCBI	
(National	Center	for	Biotechnology	Information).
Hình 2. Cây phả hệ của 23 loài Enterocytozoon hepatopenaei phân lập được 500bp
Kết	 quả	 cho	 thấy	 23	 mẫu	 phân	 lập	 có	 trình	
tự	18S	rRNA	tương	đồng	100%	với	trình	tự	18S	
rRNA	của	Enterocytozoon hepatopenaei.
Khi	so	sánh	độ	tương	đồng	nucleotide	của	23	
chủng	EHP	với	nhau,	chúng	 tôi	nhận	 thấy	 tất	cả	
23	chủng	đều	tương	đồng	100%.	Điều	này	chứng	
tỏ	trình	tự	nucleotide	SSU	rRNA	giữa	các	chủng	
EHP	có	mức	tương	đồng	cao.
Kết	 quả	 giải	 trình	 tự	 bằng	 cặp	 mồi	 đặc	 hiệu	
cho	 thấy	 23	mẫu	 từ	 tôm	 nghi	 bị	 bệnh	 vi	 bào	 tử	
trùng	 thuộc	 loài	 Enterocytozoon hepatopenaei. 
Kết	 quả	 xây	 dựng	 cây	 phân	 loài,	 các	 chủng	
Enterocytozoon	này	có	quan	hệ	gần	với	các	chủng	
gây	 bệnh	 trên	 cá	 như Nucleospora salmonis, 
75
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ 1 - 2018
Agmasoma penaei ; các	chủng	gây	bệnh	trên	côn	
trùng	như Cytosporogenes legeri, Cytosporogenes 
operophterae, Endoreticulatus bombyds, 
Endoreticulatus schubergi. Theo	 nghiên	 cứu	 của	
Tourtip	và	cs.,	(2009),	nhóm	tác	giả	nhận	thấy	trình	
tự	SSU	rRNA	của	EHP	giống	84%	so	với	trình	tự	
SSU	rRNA	của	Enterocytozoon bieneusi	và	có	quan	
hệ	gần	với	Nucleospora salmonis.	Kết	quả	này	hoàn	
toàn	tương	đồng	với	kết	quả	mà	chúng	tôi	thu	được.
IV. KẾT LUẬN 
Tỷ	lệ	nhiễm	vi	bào	tử	trùng	EHP	ở	các	tỉnh	Ninh	
Thuận,	Kiên	Giang,	Bạc	Liêu	lần	lượt	là	19,44%;	
1,16%;	2,27%,	trong	đó	tôm	thương	phẩm	có	tỷ	lệ	
nhiễm	(10,75%)	cao	hơn	so	với	tôm	post	(5,77%).	
100%	mẫu	tôm	dương	tính	là	tôm	thẻ.	
Kết	quả	giải	trình	tự	cho	thấy	vi	bào	tử	trùng	
gây	 bệnh	 trên	 tôm	 ở	 ba	 tỉnh	 Ninh	Thuận,	 Kiên	
Giang,	 Bạc	 Liêu	 thuộc	 loài	 Enterocytozoon 
hepatopenaei	và	tỷ	lệ	tương	đồng	giữa	các	chủng	
là	100%.	Kết	quả	phân	tích	cây	phân	loài	các	chủng	
Enterocytozoon phân	lập	được	có	quan	hệ	gần	gũi	
với	các	chủng	gây	bệnh	trên	cá	như	Nucleospora 
salmonis, Agmasoma penaei, và các	 chủng	 gây	
bệnh	 trên	 côn	 trùng	 như	Cytosporogenes legeri, 
Cytosporogenes operophterae,	 Endoreticulatus 
bombyds,	Endoreticulatus schubergi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.	 Bùi	 Quang	 Tề,	 Lê	 Ngọc	 Quân,	 Nguyễn	 Thị	
Biên	Thùy,	Bùi	Quang	Tâm,	Hoàng	Thị	Yến,	
Nguyễn	Thị	Niên,	Nguyễn	Văn	Thành,	 Phan	
Thị	Hường.	(2010).	Kết	quả	nghiên	cứu	bệnh	
gan	tụy	trên	tôm	sú	(Penaeus monodon)	nuôi	
ở	Việt	Nam	và	biện	pháp	phòng	ngừa.	Tạp	chí	
Khoa	học	kỹ	thuật	Thú	y,	18(2):	64-73.
2.	 Chalor	 Limsuwan,	 Niti	 Chuchird	 and	
Kesinee	 Laisutisan.	 (2008).	 Efficacy	 of	
Calcium	 Hypochlorite	 on	 the	 Prevalence	 of	
Microsporidiosis	(Thelohania)	in	Pond-Reared	
Litopenaeus vannamei. Kasetsart	J.	(Nat.	Sci.)	
42:	282	–	288.
3. John	Sackton.	(2015).	EHP	Disease	in	Shrimp	
May	be	Hard	to	Control,	Likely	Will	Increase	
Volatility	 in	Market.	Seafood.com	(an	online,	
subscription-based,	fisheries	news	service).
4.	 Kathy	 F.J.	 Tang,	 Carlos	 R.	 Pantoja,	 Rita	 M.	
Redman,	 Jee	 Eun	 Han,	 Loc	 H.	 Tran,	 Donald	
V.	 Lightner.	 (2015).	 Development	 of	 in	 situ	
hybridization	and	PCR	assays	 for	 the	detection	
of	 Enterocytozoon hepatopenaei	 (EHP),	 a	
microsporidian	parasite	infecting	penaeid	shrimp.	
Journal	of	Invertebrate	Pathology.	130.	37–41.
5.	 Karthikeyan	 Kesavan,	 Ravi	 Mani,	 Itami	
Toshiaki	 &	 Raja	 Sudhakaran.	 (2016).	 Short	
communication	 quick	 report	 on	 prevalence	 of	
shrimp	 microsporidian	 parasite	 Enterocytozoon 
hepatopenaei	in	India.	Aquaculture	research.	1–5.
6.	 Nguyễn	 Thị	 Hà,	 Đồng	 Thanh	 Hà,	 Nguyễn	
Thanh	Thủy,	Vũ	Thị	Kim	Liên.	 (2010).	 Phát	
hiện	vi	bào	tử	Enterocytozoon hepatopenaei ký	
sinh	 trên	 tôm	sú	 (Penaeus monodon)	bị	bệnh	
phân	 trắng	 nuôi	 tại	 Việt	 Nam.Tạp	 chí	 Nông	
nghiệp	và	phát	triển	nông	thôn.	Kỳ	2.
7.	 Perschbacher	 P.W.	 1995.	 Recirculation-
Aeration:	 Bibliography	 for	 Aquaculture.	
DIANE	Publishing,	Beltsrille,	MD,	USA.
8.	 Satit	 Prasertsri,	 Chalor	 Limsuwan	 and	 Niti	
Chuchird.	(2009).	The	Effects	of	Microsporidian	
(Thelohania)	 Infection	 on	 the	 Growth	 and	
Histopathological	 Changes	 in	 Pond-reared	
Pacific	White	Shrimp	(Litopenaeus vannamei).	
Kasetsart	J.	(Nat.	Sci.)	43:	680	–	688.
9.	 Somjintana	 Tourtip,	 Somjai	 Wongtripop,	
Grant	 D.	 Stentiford,	 Kelly	 S.	 Bateman,	
Siriporn	 Sriurairatana,	 Jittipan	 Chavadej,	
Kallaya	 Sritunyalucksana,	 Boonsirm	
Withyachumnarnkµl.	 (2009).	 Enterocytozoon 
hepatopenaei	 sp.	 nov.	 (Microsporida:	
Enterocytozoonidae),	 a	 parasite	 of	 the	 black	
tiger	 shrimp	 Penaeus monodon	 (Decapoda:	
Penaeidae):	 Fine	 structure	 and	 phylogenetic	
relationships.	 Journal of Invertebrate 
Pathology. 102 (2009). 21–29.
10.	Trung	 tâm	 VASEP.PRO	 (Hiệp	 hội	 VASEP).	
2015.	 Phương	 pháp	 phát	 hiện	 và	 chiến	 lược	
phòng	bệnh	hoại	tử	gan	tụy	và	bệnh	vi	bào	tử	
trùng	trên	tôm	nuôi.	
Ngày	nhận	20-9-2017
Ngày	phản	biện	15-10-2017
Ngày	đăng	1-1-2018