Tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng BVP 10.2

i 135 U/ml, phương án kết hợp 2 g pepton + 1 g 
(NH4)2SO4 enzyme laccase tổng hợp cao nhất sau 4 
ngày nuôi cấy cũng chỉ đạt 109,4 U/ml. Việc bổ sung 
nguồn nitơ vô cơ trong môi trường nuôi cấy cũng có 
tác động đến môi trường nuôi cấy, vì có thể làm điều 
chỉnh pH của môi trường nuôi cấy làm thuận lợi cho 
quá trình tổng hợp enzyme laccase. Do đó, phương 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 80 
án kết hợp 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4 được lựa 
chọn trong các nghiên cứu tiếp theo. 
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng và 
CuSO4 đến khả năng tổng hợp enzyme laccase 
Veratryl alcohol được sử dụng như cơ chất cảm 
ứng đặc hiệu cho sinh tổng hợp enzyme laccase từ vi 
sinh vật, Cu2+ có thể là một tác nhân hoạt hóa quá 
trình tổng hợp của enzyme [8]. Kết quả nghiên cứu 
ảnh hưởng của nồng độ các chất cảm ứng Veratryl 
alcohol (VA) và nồng độ CuSO4 được thể hiện trong 
hình 2. 
Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ Veratryl alcohol (A) và nồng độ CuSO4 (B) đến khả năng tổng hợp 
enzyme laccase từ nấm mốc BVP 10.2 
Nồng độ Veratryl alcohol có ảnh hưởng rõ rệt 
đến quá trình tổng hợp enzyme laccase trong môi 
trường nuôi cấy. Khi nồng độ chất cảm ứng thấp 0,1 - 
0,2 mM enzyme laccase chỉ được tổng hợp ra môi 
trường khoảng 80 - 110 U/ml, điều này có thể được lý 
giải là do nồng độ chất cảm ứng thấp chưa đủ để 
enzyme hoạt hóa. Ở nồng độ cao 0,4 mM cũng có thể 
làm ức chế sự sinh tổng hợp enzyme laccase của 
chủng nấm mốc BVP 10.2. Ở nồng độ 0,3 mM 
enzyme laccase được tổng hợp cao nhất sau 4 ngày 
nuôi cấy là 155 U/ml (cao gấp 1,3 - 1,9 lần) so với các 
nồng độ khác. 
Chất cảm ứng ở nồng độ 0,3 mM được lựa chọn 
để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến quá 
trình tổng hợp enzyme laccase cho thấy: CuSO4 250 
µm tổng hợp enzyme laccase cao nhất 175 U/ml sau 
4 ngày nuôi cấy, cao gấp 1,4 lần so với nồng độ 
CuSO4 200 µm ở cùng một thời điểm nuôi cấy. Trong 
khi đó nồng độ CuSO4 150 µm chỉ đạt cao nhất sau 4 
ngày nuôi cấy là 78 U/ml và nồng độ CuSO4 300 µm 
là 80 U/ml (quá trình tổng hợp CuSO4 đạt khoảng 
51% đến 54% so với nồng độ CuSO4 250 µm). Điều 
này có thể lý giải là do trung tâm cấu tạo của 
enzyme laccase chứa các ion Cu2+ nên CuSO4 là ion 
chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme laccase. 
Nếu nồng độ CuSO4 thấp có thể chưa đủ cho quá 
trình hoạt động của enzyme laccase, ở nồng độ cao 
lại có thể gây độc cho tế bào dẫn đến ảnh hưởng đến 
khả năng tổng hợp enzyme laccase. Do đó, CuSO4 
250 µm được lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp 
theo. 
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ 
đến khả năng tổng hợp enzyme laccase 
Hình 3. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến khả năng tổng hợp enzyme từ nấm mốc 
A B 
A 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 81 
Chủng nấm mốc BVP 10.2 được nuôi cấy trên 
các môi trường có giá trị pH khác nhau từ 5 - 7, nhiệt 
độ nuôi cấy thay đổi từ 300C, 350C, 400C, tốc độ lắc 
200 vòng/phút, lượng giống cấp ban đầu 2%. Định kỳ 
lấy mẫu xác định hoạt độ enzyme laccase. Kết quả 
đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp 
enzyme laccase của chủng BVP 10.2 được thể hiện 
trong hình 3. 
Thông thường enzyme laccase hoạt động tốt 
trong môi trường axít, trong đó pH 6 cho hoạt độ 
enzyme laccase cao nhất đạt 180 U/ml sau 4 ngày 
nuôi cấy. Ở pH 6 enzyme laccase được tổng hợp 
nhanh sau 2 ngày nuôi cấy liên tiếp là 62 U/ml, sau 
đó giảm dần ở các ngày nuôi cấy thứ 5. Ở pH 5 quá 
trình tổng hợp enzyme laccase sau 4 ngày nuôi cấy 
đạt thấp 105 - 125 U/ml (tương ứng khoảng 42 - 58% 
so với pH 6). Trong canh trường pH 7 quá trình tổng 
hợp enzyme laccase giảm chỉ còn khoảng 46% (hoạt 
độ enzyme đạt 95 U/ml). Ảnh hưởng của nhiệt độ 
nuôi cấy cũng tác động rõ rệt đến khả năng tổng hợp 
enzyme laccase. Sau 2 ngày nuôi cấy ở khoảng nhiệt 
độ 300C - 350C là khá tương đồng nhau (60 - 75 
U/ml). Tuy nhiên, ở các ngày nuôi cấy kế tiếp tốc độ 
tăng trưởng nhanh thúc đẩy quá trình tổng hợp 
enzyme laccase cũng tăng theo và đạt 190 U/ml sau 
4 ngày nuôi cấy ở 350C (tăng gấp 1,3 lần so với 300C). 
Còn ở 400C tốc độ phát triển của nấm mốc chậm, 
tổng hợp enzyme laccase cũng bị ảnh hưởng (chỉ đạt 
62%). 
Điều này cho thấy có khả năng enzyme laccase 
bị tác động bởi sự phân hủy của các sản phẩm khác 
trong quá trình trao đổi chất khi môi trường đã cạn 
kiệt nguồn dinh dưỡng và tế bào tự phân ngày càng 
tăng, việc duy trì quá trình tăng trưởng trong suốt 
quá trình nuôi cấy sẽ giúp cho sinh tổng hợp enzyme 
laccase đạt hiệu suất cao [8]. 
3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme 
laccase của nấm mốc BVP 10.2 
3.3.1. Xây dựng mô hình toán với 3 thông số 
Qua nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 
đến sinh tổng hợp enzyme laccase, ba thông số có 
ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng sinh tổng hợp 
enzyme laccase được lựa chọn: nồng độ glucose (X1, 
%); nồng độ Veratryl alcohol (X2; %) và pH môi trường 
(X3). Thiết lập ma trận thực nghiệm từ 3 thông số và 
cho kết quả theo bảng 7. 
Bảng 7. Ma trận thực nghiệm và kết quả 
TN Mã Thực 
 X1 X2 X3 X1 X2 X3 
Y1 Y2 YTB Sj
2 
1 + + + 1,4 0,04 5,5 164 162,5 163 1,25 
2 + + - 1,4 0,04 6,5 170 172 171 2 
3 - + + 0,6 0,04 5,5 138 136,4 137 1,36 
4 - + - 0,6 0,04 6,5 157 163 160 18 
5 + - + 1,4 0,02 5,5 131,5 136 134 10,25 
6 + - - 1,4 0,02 6,5 142 145,5 144 6,25 
7 - - + 0,6 0,02 5,5 112,5 109,5 111 4,5 
8 - - - 0,6 0,02 6,5 123,4 121 122 2,96 
Tổng 1140 46,57 
Kiểm tra độ đồng nhất của ma trận: 
Gtt= 39,0
57,46
18)(
2
2
 jS
SjMax 
Kiểm tra sự có nghĩa theo tiêu chuẩn Cochran 
tính Gb(f1, f2) với f1=k-1=2-1=1 
 f2=N=8, với p=0,05 
 Gb=0,6789 
Ta có Gtt<Gb ma trận đồng nhất, các số liệu đo 
với cùng độ chính xác 
Tính các hệ số của phương trình: 
 Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 82 
Vậy: 321 5,61525,105,142 XXXY 
Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số: 
Theo tiêu chuẩn Student, các hệ số có nghĩa 
nếu: 
 bi Stb  
Sb là căn bậc hai của phương sai mà các hệ số 
gánh chịu 
T: chuẩn số Student 
Ta có: 82,5
8
57,461
2
2 

N
S
S
N
j
j
y
Phương sai trung bình: 
91,2
2
82,5
2
2 
K
S
S
y
y
Phương sai mà các hệ số xác định 
73,0
4
91,2
2
2 
B
S
S
y
b
B là số hệ số 
85,073,0 bS 
Giá trị bảng tiêu chuẩn Student đối với mức ý 
nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f1=N.(K-1)=8; N=8. Tra 
bảng ta có: tb= 1,86 
Vậy: 58,185,086,1   bb St 
)3,1(58,1 ibi 
Vậy tất cả các hệ số đều có nghĩa. 
Kiểm tra sự tương ứng của mô hình theo tiêu 
chuẩn Fisher 
Bảng 8. Kiểm tra sự tương ứng của mô hình theo tiêu 
chuẩn Fisher 
TT Mô hình YTT YTN 
(YTT - 
YTN)
2 
1 142,5 + 10,25 + 15 - 6,5 161,3 163 2,89 
2 142,5 + 10,25 + 15 + 6,5 174,3 171 10,89 
3 142,5 - 10,25 + 15 - 6,5 140,8 137 14,44 
4 142,5 - 10,25 + 15 + 6,5 153,8 160 38,44 
5 142,5 + 10,25 - 15 - 6,5 131,3 134 7,29 
6 142,5 + 10,25 - 15 + 6,5 144,3 144 0,09 
7 142,5 - 10,25 - 15 - 6,5 110,8 111 0,04 
8 142,5 - 10,25 - 15 + 6,5 123,8 122 3,24 
Tổng 77,32 
 
 22 )(
1
TTTNtu YY
BN
S 19,33 
64,6
91,2
33,19
),(
),(
2
2
2
tuy
tuy
tt
SSMin
SSMax
F 
Kiểm tra sự tương thích của phương trình theo 
tiêu chuẩn Fisher. 
So sánh giá trị Ftt với Fb, trong đó p: mức ý nghĩa; 
f1: bậc tự do của phương sai dư f1= N-B = 4; f2: bậc tự 
do của phương tái hiện f2 = N(K-1) = 8. 
Tra bảng ta có Fb=7,01, suy ra Ftt< Fb. Vậy mô 
hình đã lập hoàn toàn thích ứng. 
3.3.2. Tối ưu hóa theo mô hình Box- Wilson 
Tối ưu hóa hàm mục tiêu bằng phương pháp leo 
dốc, bi là hệ số hồi qui của các yếu tố tương quan, i 
là khoảng biến thiên của từng yếu tố, theo công thức 
bi.i 
b1.1 = 10,25 x 0,4 = 4,1. 
b2.2 = 12 x 0,01 = 0,12. 
b3.3 = -6,5 x 0,5 = 3,25. 
Vậy chọn X1 làm biến cơ sở, Xcs=0,4; X2= 0,01; 
 X3= 0,5 
Bảng 9. Ma trận điều kiện tối ưu 
TN X1 X2 X3 HĐ (U/ml) 
1 0,6 0,02 5,0 129,8 
2 1,0 0,03 5,5 162,2 
3 1,4 0,04 6,0 249,3 
4 1,8 0,05 6,5 135,6 
5 2,2 0,06 7,0 118,9 
Kết quả nghiên cứu xác định môi trường nuôi 
cấy với nồng độ glucose 1,4%; Veratryl alcohol 0,04%; 
pH đầu 6,0 là môi trường tối ưu để chủng nấm mốc 
BVP 10.2 sinh tổng hợp enzyme cao nhất đạt 249,3 
U/ml. 
Để kiểm tra thực nghiệm các điều kiện đã được 
tối ưu, chủng nấm mốc BVP 10.2 được nuôi trong 
môi trường MT6 với glucose 1,4%, Veratryl alcohol 
0,04%, pH 6, ở 350C, trên máy lắc 200 vòng/phút. Thu 
100 ml canh trường sau 24 giờ để xác định sinh khối, 
pH và hoạt tính enzyme laccase. Kết quả chỉ ra trong 
hình 4. 
Kết quả thực nghiệm các điều kiện đã được tối 
ưu cho thấy nấm mốc sinh trưởng mạnh từ ngày thứ 
2 - 4, với hàm lượng sinh khối đạt từ 8,75 g/l đến 14,8 
g/l, sau đó chuyển sang pha cân bằng từ ngày thứ 5. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 83 
Bắt đầu từ ngày thứ 8 là pha suy vong. Sau 7 ngày 
nuôi cấy nấm phát triển với tốc độ cấp số nhân, đồng 
thời làm suy giảm dinh dưỡng trong môi trường nuôi 
cấy. Khi tốc độ phát triển càng mạnh đồng thời kèm 
theo đó là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất 
cũng được sản sinh ra làm ảnh hưởng đến sinh 
trưởng của nấm mốc [9]. 
Hình 4. Động thái sinh tổng hợp enzyme laccase từ 
nấm mốc BVP 10.2 
Hoạt độ enzyme laccase cũng tăng mạnh theo 
mức độ sinh trưởng của nấm mốc. Tại ngày thứ 3, 
khi sinh khối tăng theo cấp số nhân thì hoạt độ 
enzyme laccase cũng tăng đạt 137 U/ml. Tuy nhiên ở 
các ngày kế tiếp khi tốc độ sinh trưởng của nấm mốc 
duy trì ở pha cân bằng thì tốc độ tổng hợp enzyme 
laccase tăng dần lên và đạt cực đại 296 U/ml ở ngày 
thứ 7, sau đó giảm dần ở ngày thứ 8 cho đến ngày 
thứ 10 (205 U/ml xuống 125 U/ml). Theo nghiên 
cứu của Afreen, S cho thấy sinh trưởng đạt cực đại 
thì tổng hợp laccase mạnh nhất đạt 59,928 U/ml 
trong 10 ngày nuôi cấy [2]. 
pH môi trường trong quá trình sinh trưởng và 
phát triển của nấm mốc giảm dần so với ban đầu (pH 
khoảng 5,8 – 5,9), sau đó ổn định ở pH 6 và tăng dần 
ở ngày nuôi cấy thứ 6 từ 6,06 – 6,2. Ở ngày thứ 7 nuôi 
cấy khi pH môi trường duy trì ở mức 6 – 6,1 sinh 
trưởng của nấm mốc đạt 17,5 g/l và tổng hợp enzyme 
laccase đạt 296 U/ml. Thực nghiệm cho thấy, tối ưu 
các điều kiện quá trình sinh tổng hợp laccase đạt cao 
hơn so với khi điều kiện canh trường chưa tối ưu, 
phù hợp với mô hình lý thuyết. 
Theo nghiên cứu của Arora và Gill (2000) [3] 
cho thấy một gợi ý về khả năng tổng hợp laccase cao 
của chủng BVP 10.2 trên các môi trường khác với ba 
yếu tố glucose, Veratryl alcohol, pH đã được tối ưu ở 
trên cho các nghiên cứu tiếp theo. 
4. KẾT LUẬN 
Từ 18 chủng vi sinh vật có phản ứng dương tính 
với Syringaldazine và ABTS đã xác định được chủng 
nấm mốc ký hiệu BVP 10.2 có khả năng sinh tổng 
hợp enzyme laccase đạt hoạt độ enzyme cao nhất 
85,5 U/ml trong 5 ngày nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu 
xác định laccase từ chủng BVP 10.2 được tổng hợp 
cao nhất đạt 190 U/ml sau 4 ngày nuôi cấy với 2% tỷ 
lệ cấp giống ban đầu; 10 g/l glucose; 1,5 g pepton + 
1,5 g (NH4)2SO4; 0,3 mM Veratryl alcohol, nồng độ 
CuSO4 là 250 µm, pH ban đầu là 6, ở 35
0C, trên máy 
lắc với 200 vòng/phút. Trong điều kiện môi trường 
tối ưu (môi trường MT6 với glucose 1,4%; Veratryl 
alcohol 0,04%, pH 6), enzyme được tích lũy trong 
canh trường đạt 296 U/ml, tốc độ sinh trưởng đạt 
17,5 g/l ở ngày thứ 7 nuôi cấy và pH duy trì ổn định ở 
mức 6 – 6,1. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Hoàng Đình Hòa (1999). Tối ưu hóa trong 
công nghiệp thực phẩm. NXB Khoa học và kỹ thuật, 
Hà Nội. 
2. Afreen, S; Bano, F; Ahmad, N; Fatma, T 
(2017). Screening and optimization of laccase from 
cyanobacteria with its potential in decolorization of 
anthraquinonic dye Remazol Brilliant Blue R. 
Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 10, pp. 
403 - 410. 
3. Arora, D. S. & Gill, P. K. (2000). Laccase 
production by some white rot fungi under different 
nutritional conditions. Bioresource Technol, 73: 283 - 
285. 
4. Camarero, S., O. García, T. Vidal, J. Colom, J. 
C. d. Río, A. Gutiérrez, J. M. Gras, R. Monje, M. J. 
Martínez and Á. T. Martíınez (2004). Efficient 
bleaching of non-wood high - quality paper pulp 
using laccase - mediator system. Enzyme and 
Microbial Technology. 35, pp. 113 - 120. 
5. Claus, H. (2003). Laccases: structure, 
reactions, distribution. 13th International Conference 
on Invertebrate Dioxygen Binding Proteins. Mainz, 
Germany Pergamon - Elsevier Science Ltd. Pp. 
6. Gorman, M. J., N. T. Dittmer, J. L. Marshall 
and M. R. Kanost (2008). Characterization of the 
multicopper oxidase gene family in Anopheles 
gambiae". Insect Biochemistry and Molecular 
Biology. 38, pp. 817 - 824. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 84 
7. Janusz, G., J. Rogalski, M. Barwińska and J. 
Szczodrak (2006). Effects of culture conditions on 
production of extracellular laccase by Rhizoctonia 
praticola. Pol J Microbiol. 55 (4), pp. 309 - 319. 
8. Jung, H. C., F. Xu and K. C. Li (2002). 
Purification and characterization of laccase from 
wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY-
7. Enzyme and Microbial Technology. 30, pp. 161-
168. 
9. Mcneil, B. and L. M. Harvey (2008). Practical 
Fermentation Technology, Strathclyde Fermentation 
Centre, Strathclyde University, UK. 
10. Shleev, S. V., O. Morozova, O. Nikitina, E. S. 
Gorshina, T. Rusinova, V. A. Serezhenkov, D. S. 
Burbaev, I. G. Gazaryan and A. I. Yaropolov (2004). 
Comparison of physico-chemical characteristics of 
four laccases from different basidiomycetes. 
Biochimie. 86, pp. 693-703. 
11. Yoshida, H. (1883). Chemistry of lacquer 
(urushi). Journal Chemical Soccien. 43, pp. 472 -486. 
ISOLATION, EFFECTS OF CULTURE CONDITION AND OPTIMIZATION 
OF LACCASE FROM FUNGUS BVP 10.2 
Nguyen Thi Phuong Mai, Nguyen Tuan Anh, Bui Nguyen Minh Thu 
Summary 
Enzyme laccase has the ability to catalyze the conversion of phenol compounds and oxidize them to 
quinones, the oxidation reaction associated with the reduction of oxygen molecules to form water. 
Syringaldazine and ABTS were use as substrates for screeing the highest laccase enzyme activity of 85.5 
U/ml after 5 days of culture. The highest enzyme laccase reached 190 U/ml in the culture conditions with 
2% of the initial seeding rate; 10 g/l glucose; 1.5 g pepton + 1.5 g (NH4)2SO4; 0.3 mM Veratryl alcohol, 250 
µm CuSO4, pH 6 on shaker at 35
0C with shaking speed 200 rpm. The optimization studies revealed that the 
laccase yield was highes 296 U/mL when operated at the following conditions: after 7 days of incubation at 
200 rpm, pH 6.0, 1.4% glucose, 0.04% Veratryl alcohol in the production medium. 
Keywords: Enzyme laccase, Isolation, Selection, Culture conditions for laccase, Optimization. 
Người phản biện: GS.TS. Phạm Văn Toản 
Ngày nhận bài: 28/8/2020 
Ngày thông qua phản biện: 30/9/2020 
Ngày duyệt đăng: 7/10/2020