Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa (Oryza sativar L.) phục vụ nghiên cứu chuyển gen

ch sinh trưởng BAP hoặc kinetin ở các 
nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l để đánh giá khả năng 
tái sinh chồi ở các giống. Môi trường nuôi cấy được 
bổ sung 30 g/l đường, 6,5 g/l agar và điều chỉnh pH 
= 5,7 trước khi hấp khử trùng. Điều kiện nuôi cấy 
chiếu sáng 16 h/ngày, 25oC±2 trong 3-6 tuần. 
Công thức thí nghiệm được bố trí như sau: 
Công thức (CT) Nồng độ BAP hoặc kinetin 
CT1 0 mg/l 
CT2 0,5 mg/l 
CT3 1,0 mg/l 
CT4 1,5 mg/l 
CT5 2,0 mg/l 
Tỷ lệ tái sinh chồi được tính như sau: 
Số mẫu tái sinh chồi 
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = 
Số mô sẹo nuôi cấy 
x 100 (%) 
Ghi chú: Môi trường MS gồm: MS (Murashige 
và Skoog, 1962) + MS vitamin + 100 mg/l Myoinostol 
+ 30g/l đường. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 
theo dõi 100 mẫu. 
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 
Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng 
phần mềm Excel 2003 và IRRISTAT 5.0. 
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô 
sẹo 
 Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng tạo mô 
sẹo có sự khác biệt trên môi trường 2,4-D. Ở nồng độ 
1,0 mg/l 2,4-D các giống có tỷ lệ mô sẹo dao động từ 
78 đến 88%. Tỷ lệ mô sẹo tăng lên đáng kể trên môi 
trường 2,0 mg/l 2,4-D, dao động từ 78 đến 92%. Tuy 
nhiên tỷ lệ này giảm ở nồng độ 3,0 mg/l 2,4-D. Kết 
quả nghiên cứu cũng cho thấy khả năng tạo mô sẹo 
có sự khác nhau giữa các giống. Trong khi giống 
Đoàn Kết cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao ở nồng độ 1,0 
mg/l (88%), các giống còn lại cho tỷ lệ tạo mô sẹo 
cao ở nồng độ 2,0 mg/l, lần lượt là Nếp 87 (92%), 
Khang Dân (91%), Bao thai (82%) (Bảng 2, hình 1). 
Khả năng tái sinh mô sẹo ở lúa phụ thuộc chủ 
yếu vào môi trường nuôi cấy và bản chất di truyền 
của giống. Cao Lệ Quyên và cộng sự (2008) nghiên 
cứu khả năng tái sinh mô sẹo của 59 giống lúa trên 
môi trường MS cho thấy có 32 giống có khả năng 
hình thành mô sẹo, dao động từ 30 đến 98% trên môi 
trường MS bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 19 giống lúa 
không tái sinh mô sẹo trên các loại môi trường thử 
nghiệm. Tương tự, Phan Thị Thu Hiền (2012) nghiên 
cứu khả năng tạo mô sẹo của 31 giống lúa nương thu 
thập tại khu vực miền núi phía Bắc trên các môi 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 13 
trường khác nhau cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dao động 
từ 28,3 đến 85%. Phan Thị Hương và cộng sự (2014) 
nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo của 7 giống lúa, 
trong đó có 5 giống thuộc loài phụ japonica và 2 
giống indica. Kết quả cho thấy tỷ lệ tái sinh mô sẹo 
dao động từ 53 đến 86,7% trên môi trường MS bổ 
sung 2-3,0 mg/l 2,4-D. Từ các kết quả nghiên cứu 
trên cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D là phù hợp để 
tạo mô sẹo ở giống lúa Đoàn Kết. Các giống còn lại 
bao gồm Bao thai, Khang Dân, Nếp 87 cho tỷ lệ mô 
sẹo cao ở nồng độ 2,0 mg/l 2,4-D. 
Bảng 2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo ở một số giống lúa (sau 14 ngày) 
Giống 
Bao thai Đoàn Kết Khang Dân Nếp 87 2,4-D 
(mg/l) Tỷ lệ 
(%) 
Hình thái 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Hình thái 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Hình thái 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Hình thái 
mô sẹo 
0 0 - 0 - 0 - 0 - 
1,0 78a + 88a +++ 86a ++ 80a +++ 
2,0 82b ++ 78b ++ 91b ++ 92c +++ 
3,0 81b ++ 63c + 85a +++ 85b ++ 
Ghi chú: -: Không phát sinh mô sẹo; +++: mô sẹo màu vàng tươi, độ đồng đều cao; ++: Mô sẹo màu vàng 
nhạt, kích thước không đồng đều; +: Mô sẹo màu trắng đục, mềm, kích thước rời rạc; các chữ cái a, b, c, d 
khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức với mức ý nghĩa α<0,05 từ 
kết quả phân hạng Duncan. 
Hình 1. Mô sẹo tái sinh sau 14 ngày trên môi trường MS 2,0 mg/l 2,4-D của một số giống lúa 
(A) Bao thai, (B) Đoàn Kết, (C) Khang Dân, (D) Nếp 87 
3.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi 
Bảng 3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa 
Giống 
Bao thai Đoàn Kết Khang Dân Nếp 87 
Kinetin 
(mg/l) Tỷ lệ 
(%) 
Số 
chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Số 
chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Số chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ (%) Số chồi/cụm 
mô sẹo 
0 0 - 0 - 0 - 0 - 
0,5 43a 7,3 31a 4,9 17a 9,3 36a 6,3 
1,0 56c 10,2 45b 7,6 21b 8,2 61b 8,4 
1,5 63d 9,2 62d 7,9 58d 11,2 70c 9,8 
2,0 49b 9,8 51c 8,8 31c 7,2 67d 6,7 
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa giữa các 
công thức với mức ý nghĩa α<0,05 từ kết quả phân hạng Duncan. 
A B C D 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 14 
Hình 2. Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trường kinetin 1,5 mg/l sau 28 ngày nuôi cấy: 
(A) Bao thai, (B) Đoàn Kết, (C) Khang Dân, (D) Nếp 87 
Để đánh giá khả năng tái sinh cây in vitro, mô 
sẹo màu vàng tươi, kích thước đồng đều được 
chuyển sang môi trường bổ sung kinetin ở các nồng 
độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l. Kết quả cho thấy, sau 28 ngày 
nuôi cấy mô sẹo có khả năng tái sinh cây ở môi 
trường bổ sung kinetin ở các nồng độ từ 0,5 đến 2,0 
mg/l. Tuy nhiên tỷ lệ tái sinh cây in vitro có sự khác 
nhau ở các nồng độ kinetin. Nhìn chung cả 4 giống 
lúa đều có tỷ lệ tái sinh cao nhất ở nồng độ kinetin 
1,5 mg/l, dao động từ 58 đến 70%. Trong đó giống 
Nếp 87 có tỷ lệ tái sinh cao nhất (70%), tiếp đến là các 
giống Bao thai (63%), Đoàn Kết (62%) và Khang Dân 
(58%). Số chồi trung bình từ 7,9 đến 11,2 chồi/cụm 
mô sẹo ở nồng độ kinetin 1,5 mg/l tùy từng giống 
(Bảng 3, hình 2). 
3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh 
chồi 
Tương tự như kinetin, thí nghiệm cũng tiến hành 
đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh 
chồi. Tỷ lệ tái sinh chồi thay đổi trên môi trường có 
nồng độ kinetin khác nhau, dao động từ 46 đến 79% 
đối với giống lúa Bao thai, 45 đến 78% ở giống Đoàn 
Kết, 34 - 79% ở giống Khang Dân và 36 đến 83% đối 
với giống lúa Nếp 87. Các giống lúa đều có tỷ lệ tái 
sinh tốt nhất ở nồng độ kinetin 1,0 mg/l sau 28 ngày 
nuôi cấy, dao động từ 78 đến 83%. Số chồi/cụm mô 
sẹo dao động từ 4,3 đến 11,3 chồi. Trong đó giống 
lúa Nếp 87 có số chồi/cụm mô sẹo cao nhất (11,3 
chồi), tiếp đến là giống Đoàn Kết (6,6 chồi), Khang 
Dân (5,2 chồi), Bao thai (4,3 chồi) (Bảng 4, hình 3). 
Bảng 4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa 
Giống 
Bao thai Đoàn Kết Khang Dân Nếp 87 
BAP 
(mg/l) Tỷ lệ 
(%) 
Số 
chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Số 
chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Số 
chồi/cụm 
mô sẹo 
Tỷ lệ 
(%) 
Số chồi/cụm mô 
sẹo 
0,0 0 0 0 0 0 0 0 - 
0,5 46a 1,3 45a 2,3 34a 2,3 36a 3,4 
1,0 79c 4,3 78c 6,6 79d 5,2 83d 11,3 
1,5 74c 3,6 64b 4,3 56b 4,3 74c 5,3 
2,0 56b 3,5 66b 4,2 64c 3,3 65b 2,3 
Các chữ cái a, b, c, d khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức 
với mức ý nghĩa α<0,05 từ kết quả phân hạng Duncan. 
Hình 3. Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trường BAP 1,0 mg/l sau 28 ngày nuôi cấy 
(A) Bao thai, (B) Đoàn Kết, (C) Khang Dân, (D) Nếp 87 
D A B C 
B D A C 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 15 
Nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng tái sinh in 
vitro ở lúa phụ thuộc vào giống và chất kích thích 
sinh trưởng (Cao Lệ Quyên và cộng sự, 2008, Phan 
Thị Hương và cộng sự 2014). Từ kết quả nghiên cứu 
tái sinh in vitro của 7 giống lúa Phan Thị Hương và 
cộng sự (2014) kết luận rằng BAP có khả năng tái 
sinh tốt hơn kinetin. Trên môi trường bổ sung 3,0 
mg/l BAP toàn bộ (100%) mô sẹo có khả năng tái 
sinh cây, số chồi/cụm mô sẹo từ 13,67 đến 16,33 
chồi. Trong khi đó trên môi trường kinetin tỷ lệ mô 
sẹo tái sinh chỉ đạt từ 2,67 đến 11,67%, số chồi/cụm 
mô sẹo chỉ đạt 0,1-0,3 chồi tùy từng giống (Phan Thị 
Hương và cộng sự, 2014). Để nâng cao khả năng tái 
sinh, một số công bố cho rằng có thể sử dụng kết 
hợp các chất kích thích sinh trưởng như 2,4-D, NAA 
với BAP và kinetin. Mannan et al. (2013) cho rằng 
cần phải bổ sung 2,4-D vào môi trường tái sinh đối 
với các giống lúa Kalijira và Chinigura, BR29, IR64. 
Phan Thị Hương và cộng sự (2014) bổ sung NAA vào 
môi trường tái sinh cho hiệu quả cao đối với giống 
J02 và Hương cốm. 
Hiệu quả chuyển gen ở cây trồng nói chung và 
cây lúa nói riêng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong 
đó hệ thống tái sinh in vitro tạo cây hoàn chỉnh có vai 
trò quyết định. Để thu được cây chuyển gen thông 
thường phải qua nhiều giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc 
các tế bào mang gen bằng các kháng sinh như 
hygromycin, kanamycin, glufosinate... vì vậy giống 
có khả năng tái sinh cây tốt, tỷ lệ chồi tái sinh cao sẽ 
tăng tỷ lệ chọn lọc được chồi chuyển gen. Do đó việc 
xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái 
sinh in vitro và lựa chọn được vật liệu tái sinh tốt có ý 
nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu chuyển gen ở 
cây lúa. 
Từ kết quả nghiên cứu tái sinh ở 4 giống lúa Bao 
thai, Đoàn Kết, Khang Dân và Nếp 87 cho thấy, các 
giống đều có khả năng tái sinh tốt trên môi trường 
BAP và kinetin. Môi trường tái sinh bổ sung 1,0 mg/l 
BAP cho hiệu quả tái sinh tốt hơn các môi trường 
còn lại. Tuy nhiên, để nâng cao hơn nữa hiệu quả tái 
sinh ở các giống lúa trên có thể tiến hành thử 
nghiệm kết hợp BAP, kinetin và NAA ở giai đoạn tái 
sinh từ đó tối ưu quy trình tái sinh in vitro phục vụ 
cho các nghiên cứu chuyển gen. 
4. KẾT LUẬN 
Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro từ 
mô sẹo của 4 giống lúa Bao thai, Đoàn Kết, Khang 
Dân và Nếp 87 cho thấy: 
- Môi trường MS cơ bản + 100 mg/l myoinostol + 
30 g/l đường + 6,5 g/l agar (pH=5,6) bổ sung 1,0 mg/l 
2,4-D là phù hợp để tạo mô sẹo ở giống lúa Đoàn Kết. 
Các giống lúa Bao thai, Khang Dân, Nếp 87 cho tỷ lệ 
mô sẹo cao ở nồng độ 2,0 mg/l 2,4-D. 
 - Khả năng tái sinh in vitro từ mô sẹo trên môi 
trường MS cơ bản + 100 mg/l myoinostol + 30 g/l 
đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,5 mg/l kinetin cho tỷ 
lệ tái sinh chồi cao nhất ở giống Nếp 87 (70%), tiếp 
đến là các giống Bao thai (63%), Đoàn Kết (62%) và 
Khang Dân (58%). 
 - Khả năng tái sinh in vitro từ mô sẹo trên môi 
trường MS cơ bản + 100 mg/l myoinostol + 30 g/l 
đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,0 mg/l BAP cho tỷ lệ 
tái sinh chồi cao nhất ở giống Nếp 87 (83%), tiếp đến 
là các giống Khang Dân (79%), Bao thai (79%), Đoàn 
Kết (78%). 
LỜI CẢM ƠN 
Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa 
học và Công nghệ đã cấp kinh phí cho đề tài hợp tác 
nghiên cứu song phương và đa phương giữa Trường 
Đại học Quốc gia Kyungpook Hàn Quốc và Trường 
Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên. Mã số 
HNQT/SPĐP/13.19. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Cao Lệ Quyên, Lê Kim Hoàn, Lê Huy Hàm, 
Phạm Xuân Hội (2008). Nghiên cứu khả năng tái 
sinh cây lúa từ phôi của tập đoàn các giống lúa Việt 
Nam nhằm phục vụ cho công tác chuyển gen. Tạp 
chí Sinh học 30 (3): 141-147. 
2. Daisuke Fujita, Kurniawan Rudi Trijatmiko, 
Analiza Grubanzo Tagle, Maria Veronica Sapasap, 
Yohei Koide, Kazuhiro Sasaki, Nikolaos 
Tsakirpaloglou, Ritchel Bueno Gannaban, Takeshi 
Nishimura, Seiji Yanagihara, Yoshimichi Fukuta, 
Tomokazu Koshiba, Inez Hortense Slamet-Loedin, 
Tsutomu Ishimaru and Nobuya Kobayashi (2013). 
NAL1allele from a rice landrace greatly increases 
yield in modern indica cultivars. PNAS Early Edition, 
1 - 6. 
3. Sahoo Khirod K, Amit K Tripathi, Ashwani 
Pereek, Sudhir K Sopory and Sneh L Singla Pareek 
(2011). An imoroved protocol for efficient 
transformation and regeneration of diverse indica 
rice cultivars. Plant methods, 2 - 11. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 16 
4. Mannan M. A., Sarker T. C, Akhter M. T, 
Kabir A. H and Alam M. F. (2013). Indirect plant 
regeneration in aromatic rice (Oryza sativa L.) var. 
“Kalijira” and “Chinigura”. Acta agriculturae 
Slovenica 101 (2): 231 – 238. 
5. Murashige T. and Skoog F. (1962). A revised 
medium for rapid growth andbioassays with tobacco 
tissue culture. Physiologia Plantarum, 15 (3): 473 - 
479. 
6. Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Phương Thảo, 
Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Tràng Hiếu, Ninh 
Thị Thảo (2014). Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro 
trên cây lúa. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2014, 
tập 12, số 8: 1249 - 1257. 
7. Phan Thị Thu Hiền (2012). Khả năng tạo 
callus và tái sinh cây của tập đoàn 31 giống lúa nương 
miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen. 
Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(4): 567-575. 
8. Yukoh Hiei and Toshihiko Komari (2006). 
Improved protocol for transformation of indica rice 
mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant cell, 
Tissue and Organ culture 85: 271-283. 
9. Yukoh Hiei and Toshihiko Komari (2008). 
Agrobacterium – mediated transformation of rice 
using immature embryos or calli induced from 
mature seed. Nature protocols, Vol 3, No 5. 824 - 834. 
10. Zhang H (2013). Simultaneous improvement 
and genetic dissection of grain yield and its related 
traits in a backbone parent of hybrid rice (Oryza 
sativa L.) using selective introgression. Mol Breed 31 
(1): 181-194. 
STUDY ON IN VITRO REGENERATION IN SOME RICE (Oryza sativar L.) CULTIVARS FOR 
TRANSFORMATION APPROACH 
La Van Hien1, Nguyen Van Thanh1, Nguyen Xuan Vu1, 
Bui Tri Thuc1, Nguyen Thi Tinh1, Ngo Xuan Binh1, 2, Nguyen Tien Dung1* 
1Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry 
2Ministry of Science and Technology 
1Email: nguyentiendung@tuaf.edu.vn 
Summary 
Rice is one of main staple crops in Vietnam, however, recent years the adverse impacts of climate changes 
such as drought, salinity, high temperature, have been effecting on rice yield and production. Study on 
rice breeding with high yield, and adaptation to climate changes is a challenge for scientist. It is necessary 
application of modern biotechnologies as genome editing, transformation, target mutation or molecular 
assisted selection (MAS) to improve the efficiency of rice breeding. In rice, the ability of in vitro 
regeneration plays critical roles in the breeding process through somatic embryo (callus) that have 
reported be affected by some factors including genotypes and medium culture. In this study we carried out 
the series of experiments for evaluating the impact of 2.4-D, BAP and kinetin on callus induction, in vitro 
shoot regeneration of 4 rice cultivars growing in Northern mountain region: Doan Ket, Bao thai, Khang Dan 
and Nep 87. The results showed that MS medium supplemented 2 mg/l 2.4-D gave highest percentage of 
callus induction for all tested cultivars, range 78 to 92%. Of which Khang dan and Nep 87 showed the rate of 
callus induction higher than the others, 91% and 92% respectively after 28 days cultured. Shoot regeneration 
rate was range from 78 to 83% with 4.3 to 11.3 shoot number per callus cluster on MS + 1 mg/l BAP 
medium. Results indicated that those rice cultivars can be used as material explant for rice breeding using 
transformation or genome editing techniques. 
Keywords: BAP, callus, in vitro, kinetin, 2,4-D. 
Người phản biện: PGS.TS. Khuất Hữu Trung 
Ngày nhận bài: 18/9/2020 
Ngày thông qua phản biện: 19/10/2020 
Ngày duyệt đăng: 26/10/2020