Thiết kế hệ thống cấu trúc vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmNAC29 liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương

vùng exon và intron. Trong đó, 
Glyma.20G033300.1 có chứa 3 vùng exon có kích 
thước khác nhau để mã hóa liên tục cho gen 
GmNAC29 có chiều dài 843 bp (Hình 1). 
Hình 2. Kết quả phân tích trình tự DNA và protein 
của GmNAC29 
Chú thích: (a) cấu trúc của GmNAC29; (b) Vùng bảo 
thủ của GmNAC29 ở đầu N- 
Tiếp theo, khi phân tích trình tự DNA của 
GmNAC29 trên web 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb
.cgi, kết quả cho thấy GmNAC29 mã hóa cho 281 
amino axit nằm ở phân họ NAM (No Apical 
Meristem) của họ yếu tố phiên mã NAC (Hình 2a). 
Hơn nữa, khi phân tích trình tự protein của 
GmNAC29 ở đầu N-, kết quả cho thấy GmNAC29 có 
chứa 5 vùng bảo thủ (A-E) và các vùng bảo thủ này 
tương đồng với một số protein NAC ở một số đối 
tượng cây trồng khác, cụ thể là cây cải xoong. 
Qua kết quả tìm kiếm này cho thấy, GmNAC29 
là một gen thuộc họ yếu tố phiên mã NAC có chiều 
dài là 843 bp và mã hóa cho 281 amino axit. Từ đây, 
đã lựa chọn gen GmNAC29 là đối tượng cần chỉnh 
sửa và sử dụng trình tự của nó để thiết kế các sgRNA 
cho xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 mang 
sgRNA để chỉnh sửa gen GmNAC29. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 6 
3.2. Kết quả thiết kế các sgRNA của gen 
GmNAC29 
Hình 3. Vị trí các đoạn sgRNA trên trình tự gen 
GmNAC29 
Từ thông tin đối tượng cần chỉnh sửa và vị trí 
locus cần chỉnh sửa cung cấp cho công cụ CRISPR-
P2, đã chỉ ra được vị trí của toàn bộ các sgRNA trên 
trình tự của GmNAC29 (Hình 3). Kết quả ở hình 3 
cho thấy có tổng số 169 sgRNA được tìm thấy trên 
toàn bộ vùng trình tự của Glyma.20G033300.1. Từ kết 
quả đó đã lựa chọn được 2 sgRNA nhằm chỉnh sửa 
gen GmNAC29 nằm trên vùng exon 1 trong vùng bảo 
thủ đặc trưng của NAC ở đầu N- (Bảng 2). 
Bảng 2. Các sgRNA được lựa chọn cho chỉnh sửa gen GmNAC29 
STT Tên Trình tự đích sgRNA Vị trí Số lượng 
ngoài mục 
tiêu đích 
(<4 MMs) 
1 sgRNA1 AGCCACCTCAAAGCCATGCC GGCATGGCTTTGAGGTGGCT 90 3 
2 sgRNA2 GGTATATTAATTGTAACATC GATGTTACAATTAATATACC 165 9 
Hai sgRNA(1,2) được lựa chọn như trong bảng 2 
nằm lần lượt ở vị trí nucleotide 90 và 165 trong vùng 
bảo thủ đặc trưng của đầu N-. Ngoài ra, khi phân tích 
off-target của 2 sgRNA(1,2) cho thấy, chúng có thể 
chỉnh sửa một số gen đích ngoài mục tiêu GmNAC29 
với sự bắt cặp không phù hợp (mismatch, MM) < 4. 
Qua kết quả này, 2 trình tự sgRNA của gen 
GmNAC29 đã được lựa chọn để thiết kế cấu trúc 
vector CRISPR/Cas9 mang cả 2 trình tự sgRNA cho 
chỉnh sửa gen GmNAC29 ở cây đậu tương. 
3.3. Thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 
chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmNAC29 
Hình 4. Kết quả khuếch đại promoter U6 và các 
sgRNA(1,2) bằng PCR và kiểm tra sản phẩm tái tổ 
hợp của các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) 
Chú thích: (a) Sản phẩm khuếch đại của 
promoter U6 và các sgRNA(1,2); (b) Sản phẩm tái tổ 
hợp của các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) được cắt 
kiểm tra bằng enzyme giới hạn BpiI. M, thang chuẩn 
DNA 100 bp plus; 1, sản phẩm PCR của promoter U6; 
2-3, sản phẩm PCR của các đoạn DNA chứa các 
sgRNA(1,2) của GmNAC29; 4-7, các khuẩn lạc của 
U6:GmNAC29_sgRNA1; 8-11, các khuẩn lạc của 
U6:GmNAC29_sgRNA2; 14-17 
Để tiến hành thiết kế cấu trúc vector có chứa hệ 
thống CRISPR/Cas9 cùng với các sgRNA(1,2) cho 
chỉnh sửa gen GmNAC29, trước tiên, promoter U6 và 
các sgRNA(1,2) được khuếch đại bằng PCR không 
có bổ sung DNA khuôn với các cặp mồi như trình 
bày ở bảng 1. Cụ thể, promoter U6 được khuếch đại 
bằng cặp mồi U6-F/U6-R và các đoạn DNA có chứa 
các sgRNA(1,2) của GmNAC29 sử dụng các cặp mồi 
sgRNA(1,2)-F/sgRNA-R tương ứng. Hơn nữa, ở đầu 
5’ của các mồi đều được bổ sung vị trí của enzyme 
giới hạn BsaI GGTCTCA(N4). 
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của 
promoter U6 có kích thước khoảng 106 bp và các 
đoạn DNA chứa các sgRNA(1,2) của GmNAC29 có 
kích thước khoảng 135 bp (Hình 4A). Sản phẩm PCR 
tinh sạch của promoter U6 và các đoạn DNA của các 
sgRNA(1,2) được sử dụng cho phản ứng Golden 
gate. Trong đó, các sản phẩm PCR và vector tiếp 
nhận pICH47751 cùng được xử lý bởi enzyme giới 
hạn BsaI và phản ứng ghép nối được thực hiện nhờ 
sự có mặt của enzyme T4 DNA ligase. 
Các vector tái tổ hợp chứa cấu trúc 
U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) của phản ứng Golden 
gate được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 7 
bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn sau khi 
biến nạp được cấy trải và nuôi qua đêm trên đĩa môi 
trường LB đặc có bổ sung 20 mg/L X-Gal kết hợp với 
125 mg/L ampicillin ở 37oC. Bốn khuẩn lạc màu 
trắng cho mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được 
lựa chọn để nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB 
lỏng có bổ sung 125 mg/L Ampicilin để tách chiết 
thu DNA plasmid. Các vector tái tổ hợp cho mỗi 
U6:GmNAC29_sgRNA được cắt kiểm tra bằng 
enzyme giới hạn BpiI. 
Kết quả điện di cho thấy, với mỗi cấu trúc tái tổ 
hợp U6:GmNAC29_sgRNA sau khi cắt đều có 2 vạch 
băng trên bản gel. Cụ thể, 1 băng có kích thước 
khoảng 4352 bp trùng với kích thước của vector 
pICH47751 và 1 băng có kích thước 237 bp được dự 
đoán là của các cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) 
(Hình 4B). Như vậy, bước đầu cho thấy việc tách 
dòng và ghép nối các đoạn sgRNA(1,2) của 
GmNAC29 và promoter U6 vào vector tiếp nhận 
pICH47751 đã thành công. 
Tiếp theo, 2 trong số 4 khuẩn lạc dương tính với 
mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được lựa chọn để 
giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’-
GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy 
giải trình tự Sanger. 
Bảng 3. Kết quả giải trình tự các cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) 
U6:GmNAC29_sgRNA1 U6:GmNAC29_sgRNA2 
tctgtGAAGACaaACTAgaattcccatggggagTgatcaaaag
tcccacatcgatcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgataga
gtcgacatagcgattgGGCATGGCTTTGAGGTGGCTgtt
ttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttg
aaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgtac
aaagttggcattacgctTTACttGTCTTCtgcac 
TctgtGAAGACaaTTACgaattcccatggggagTgatcaaaa
gtcccacatcgatcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgatag
agtcgacatagcgattgGATGTTACAATTAATATACCgt
tttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt
gaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgt
acaaagttggcattacgctCAGAttGTCTTCtgcac 
Chú thích: Chữ in đậm màu đỏ, vị trí enzyme giới hạn BsaI nhận biết; chữ in đậm màu xanh, vị trí cắt của 
enzyme giới hạn BsaI; chữ gạch chân, trình tự các sgRNA. 
Kết quả giải trình tự cho thấy, tất cả 2 vector 
pICH47751 có chứa các cấu trúc 
U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) và đều mang trình tự 
chính xác của promoter U6 và theo sau là các 
sgRNA(1,2) của GmNAC29 (Bảng 3). 
Hình 5. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp 
pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) bằng enzyme giới 
hạn BamHI 
 Chú thích: M, 1Kb plus ladder; 1-3, DNA 
plasmid của các khuẩn lạc 
pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2). 
Tiếp theo, cả 2 vector pICH47751 chứa các cấu 
trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) được sử dụng để 
ghép nối các cấu trúc này vào vector binary pID 
trong phản ứng Golden gate. Sản phẩm tái tổ hợp của 
cấu trúc vector pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) được 
biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10. Sau đó, 
dịch khuẩn được cấy trải và nuôi qua đêm trên đĩa 
LB có bổ sung 50 mg/L kháng sinh kanamycin ở 
37oC. Ba trong số các khuẩn lạc trắng được lựa chọn 
để tiếp tục nuôi tăng sinh khối trong LB lỏng có bổ 
sung 50 mg/L kanamycin cho tách chiết và tinh sạch 
DNA plasmid phục vụ cho việc giải trình tự và cắt 
kiểm tra bằng enzyme giới hạn. 
Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp 
pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) bằng enzyme giới 
hạn BamHI cho thấy, các sản phẩm cắt đều có 2 
băng; trong đó, 1 băng có kích thước khoảng 7738 bp 
có chứa vùng trình tự của 2 tổ hợp cấu trúc 
U6:GmNAC29_sgRNA(1,2), trùng với kích thước dự 
đoán và 1 băng có kích thước khoảng 4039 bp có 
chứa trình tự của gen Bar và Cas9 (Hình 5). Để đảm 
bảo sự chính xác, hai trong số ba khuẩn lạc đã được 
lựa chọn để giải trình tự kiểm tra lại. Kết quả cho 
thấy, vector pID chứa 2 tổ hợp cấu trúc 
U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) có trình tự hoàn toàn 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 8 
chính xác như trình bày ở bảng 3 và được sắp xếp 
như trong hình 6. 
Hình 6. Cấu trúc vector 
pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) và tổ hợp cấu trúc 
các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) cho chỉnh sửa gen 
GmNAC29 
Chú thích: (a) Cấu trúc vector 
pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2). (b) Tổ hợp cấu trúc 
chứa các sgRNA của GmNAC29. LB, biên trái; NOSp-
BAR-NOST, chỉ thị gen bar kháng glufosinate; 2x35S-
hSpCas9-tNOS, Cas9 được điều khiển bởi promoter 
35S; U6:GmNAC29_sgRNA(1,2), vị trí lần lượt của 
các sgRNA của GmNAC29 từ trái sang phải; RB, biên 
phải; pVS1, vùng bắt đầu sao chép; nptII, chỉ thị gen 
nptII kháng kanamycin. 
Qua hình 6 cho thấy, vector binary pID có chứa 
tổ hợp cấu trúc cho chỉnh sửa gen GmNAC29 ở cây 
đậu tương được sắp xếp lần lượt từ vùng LB sang RB 
gồm có: 1 vùng chứa đoạn gen Bar, 1 vùng chứa 
Cas9 được điều khiển bằng promoter 2x35S, và 2 
sgRNA được điều khiển bởi promoter U6 riêng biệt, 
cùng với hệ thống chọn lọc đối với vi khuẩn là kháng 
sinh kanamycin và thực vật là glufosinate. Với kết 
quả này, cấu trúc vector binary pID có chứa hệ thống 
CRISPR/Cas9 và các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) cho 
chỉnh sửa gen GmNAC29 ở cây đậu tương đã được 
thiết kế thành công. Kỹ thuật chỉnh sửa gen bằng 
công nghệ CRISPR/Cas9 được biết tới là một công 
cụ hữu ích trong nghiên cứu chức năng cụ thể của 
một gen, gần đây hơn kỹ thuật này cũng đã được ứng 
dụng trong nghiên cứu chỉnh sửa các gen liên quan 
tới các đặc tính chống chịu với các điều kiện môi 
trường bất lợi khác nhau trên một số đối tượng cây 
trồng quan trọng (Bao et al., 2019). 
4. KẾT LUẬN 
Các kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, hệ 
thống vector CRISPR/Cas9 chứa tổ hợp các 
U6:sgRNA(1,2) cho chỉnh sửa có định hướng gen 
GmNAC29 đã được thiết kế thành công. Thành công 
của nghiên cứu này sẽ cung cấp hệ thống vector 
CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen đích GmNAC29 ở 
cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng chống 
chịu hạn. 
LỜI CẢM ƠN 
Công trình nghiên cứu được thực hiện trong 
khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu bước đầu tạo cây đậu 
tương tăng cường khả năng chịu hạn bằng kỹ thuật 
CRISPR/Cas9” theo Quyết định số 617/QĐ-KHNN-
KH ngày 31/7/2019 của Giám đốc Viện Khoa học 
Nông nghiệp Việt Nam về việc Phê duyệt danh mục 
các nhiệm vụ thường xuyên Phòng Thí nghiệm 
Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật thực hiện từ 
năm 2019. Công trình nghiên cứu được đồng tài trợ 
bởi Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc (Mã số Đề 
tài NRF 2020M3A9I4038352 
và 2020R1A6A1A03044344). 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bao A., Burritt D. J., Chen H., Zhou X., Cao 
D., & Tran, L. P. 2019. The CRISPR/Cas9 system 
and its applications in crop genome editing. Crit Rev 
Biotechnol, 39(3): 321-336. 
2. Basu S., Ramegowda V., Kumar A., Pereira 
A. (2016). Plant adaptation to drought stress. 
F1000Res, 5: 1554. 
3. Nguyễn Hữu Kiên, Nguyễn Văn Đồng 
(2016). Yếu tố phiên mã NAC trong thực vật: vai trò 
và tiềm năng ứng dụng. Hội thảo Quốc gia về Khoa 
học cây trồng lần thứ hai, 2: 302-306. 
4. Nuruzzaman M., Sharoni A. M., Kikuchi S. 
(2013). Roles of NAC transcription factors in the 
regulation of biotic and abiotic stress responses in 
plants. Front. Microbiol, 4: 248. 
5. Puranik S., Sahu P. P., Srivastava P. S., 
Prasad M. (2012). NAC proteins: regulation and role 
in stress tolerance. Trends Plant Sci, 17: 369–381. 
6. Ohbayashi I., Sugiyama M. (2018). Plant 
nucleolar stress response, a new face in the NAC-
dependent cellular stress responses. Front. Plant Sci, 
8: 2247. 
7. Singh D., Yadav N. S., Tiwari V., Agarwal P. 
K., Jha B. (2016). A SNARE-like superfamily protein 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 9 
SbSLSP from the halophyte salicornia brachiata 
confers salt and drought tolerance by maintaining 
membrane stability, K(+)/Na(+) ratio, and 
antioxidant machinery. Front. Plant Sci, 7: 737. 
8. Song L., Prince S., Valliyodan B., Joshi T., 
Maldonado dos Santos J. V., Wang J., Lin L., Wan J., 
Wang Y., Xu D., Nguyen H. T. (2016). Genome-wide 
transcriptome analysis of soybean primary root 
under varying water-deficit conditions. BMC 
Genomics, 17: 57. 
9. Tak H., Negi S., Ganapathi T. R. (2017). 
Banana NAC transcription factor MusaNAC042 is 
positively associated with drought and salinity 
tolerance. Protoplasma, 254: 803–816. 
10. Thirumalaikumar V. P., Devkar V., Mehterov 
N., Ali S., Ozgur R., Turkan I., Mueller-Roeber B., 
Balazadeh S. (2017). NAC transcription factor 
JUNGBRUNNEN1 enhances drought tolerance in 
tomato. Plant Biotechnol. J, 16: 354–366. 
11. Valliyodan B., Ye H., Song L., Murphy M., 
Shannon J. G., Nguyen H. T. (2017). Genetic 
diversity and genomic strategies for improving 
drought and waterlogging tolerance in soybeans. J. 
Exp. Bot, 68: 1835–1849. 
12. Wang F., Chen H. W., Li Q. T., Wei W., Li 
W., Zhang W. K., Ma B., Bi Y. D., Lai Y. C., Liu X. L., 
Man W. Q., Zhang J. S., Chen S. Y. (2015). 
GmWRKY27 interacts with GmMYB174 to reduce 
expression of GmNAC29 for stress tolerance in 
soybean plants. The Plant Journal, 83(2): 224-236. 
13. Werner S., Engler C., Weber E., Gruetzner 
R., Marillonnet S. (2012). Fast track assembly of 
multigene constructs using Golden Gate cloning and 
the MoClo system. Bioeng Bugs, 3(1): 38-43. 
CONSTRUCTION OF THE CRISPR/Cas9 VECTOR SYSTEM FOR EDITING GmNAC29 GENE 
RELATED TO DROUGHT TOLERANCE IN SOYBEAN 
Nguyen Huu Kien1,a, Vu Van Tien1,2,a, Le Thi Mai Huong1, 
Nguyen Trung Anh1, Dinh Thi Mai Thu1, Nguyen Thi Hoa1, 
Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, Pham Xuan Hoi1, 
Jae-Yean Kim2*, Nguyen Van Dong1* 
1National Key Laboratory for Plant Cell Biotechnology, Agricultural Genetics Institute, Vietnam 
Academy of Agricultural Sciences, Hanoi, Vietnam 
2Division of Applied Life Science (BK21 program), Plant Molecular Biology and Biotechnology 
Research Center, Gyeongsang National University, Republic of Korea. 
aEqually contributed 
*Email: kimjaeyean@gmail.com and dongjircas@yahoo.com 
Summary 
Soybean (Glycine max L.) is one of the most highly valuable legumes planted in many regions around the 
world. However, soybean is considered one of the most drought susceptible plants. The NAC transcription 
factors have been well-known to be involved in regulation of plant response and tolerance to drought. 
GmNAC29 was shown to act as a negative regulator in plant response to abiotic stresses, including drought. 
Thus, in this study, we conducted to construct the CRISPR/Cas9 gene-editing vector system carrying 
sgRNAs of GmNAC29. The result will provide a CRISPR/Cas9-mediated mutagenic system for the 
GmNAC29 gene related to drought tolerance in soybean plants. 
Keywords: CRISPR/Cas9, drought stress, NAC, PCR, soybean. 
Người phản biện: TS. Nguyễn Xuân Thắng 
Ngày nhận bài: 13/7/2020 
Ngày thông qua phản biện: 13/8/2020 
Ngày duyệt đăng: 20/8/2020