Phân lập và thiết kế gRNA chỉnh sửa promter OsSWEET13 liên quan đến bệnh bạc lá trên lúa Bắc thơm 7

có điểm cắt 
tác động đến Exon I (Bảng 2). 
Bảng 2. Trình tự gRNA chỉnh sửa SW13-BT 
Tên Trình tự gRNA-PAM (5'-3’) 
Kích 
thước 
TBP CBP IBP DSL 
GC 
On 
score 
Đích tác 
động* 
gRNA-1 
AGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 19 12 7 0 - 45 0,3391 
1PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-2 
AACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 19 6 3 0 - 40 0,0963 
3PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-3 
ACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 19 5 3 0 - 45 0,0812 
2PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-4 
AAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 20 6 3 0 - 40 0,0963 
3PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-5 
AACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 20 6 3 0 - 40 0,0812 
2PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-6 
GGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 21 9 3 0 - 50 0,3391 
1PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-7 
AAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 21 6 3 0 - 40 0,0963 
3PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-8 
AAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 21 6 3 0 - 40 0,0812 
2PthXo2(A)-
EBE 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 25 
gRNA-9 
TGGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 22 12 3 0 SL1 50 0,3391 
1PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-10 
GAAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 22 11 3 0 - 40 0,0963 
3PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-11 
AAAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 22 6 3 0 - 40 0,0812 
2PthXo2(A)-
EBE 
gRNA-12 TTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 19 5 5 0 - 35 0,2999 5Exon I 
gRNA-13 CCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 19 7 7 0 - 35 0,1298 4Exon I 
gRNA-14 CCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 20 7 7 0 - 40 0,1933 4Exon I 
gRNA-15 CTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 21 7 7 0 - 35 0,3765 5Exon I 
gRNA-16 CCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 21 7 7 0 - 45 0,1539 4Exon I 
gRNA-17 CCTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 22 7 7 0 - 35 0,3004 5Exon I 
gRNA-18 CCCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 22 7 7 0 - 50 0,1539 4Exon I 
Ghi chú: (  GC) tỉ lệ phần trăm GC; (TBP) tổng số cặp bazơ; (CBP) số cặp bazơ liên tục; (IBP) số cặp 
bazơ trong cấu trúc của gRNA; (DSL) vòng loop bị phá vỡ cấu trúc; (SL1) Stem loop 1; (-) không ảnh 
hưởng đến cấu trúc vòng loop; (PthXo2) EBE trên promoter SW13-BT; (On score) Điểm dự đoán khả 
năng nhận biết đúng vị trí đích (từ 0,00 – 1,00); (*) các gRNA cùng chỉ số có cùng một vị trí cắt trên 
PthXo2(A)-EBE hoặc Exon I. Trình tự PAM được in đậm. 
Hình 4. Cấu trúc bậc II của gRNA-6 
Mô hình cấu trúc bậc II được dự đoán bằng phần 
mềm Mfold 2.3 mang vùng gRNA (CRISPR RNA) và 
các cấu trúc vòng loop: Stem loop RAR (repeat and 
anti-repeat region), Stem loop 2 và Stem loop 3. 
Để đảm bảo khả năng duy trì hoạt tính và tính 
đặc hiệu của phức hệ CRISPR/CAS9 trong nhân tế 
bào, gRNA phải có hàm lượng GC trong trình tự 
gRNA từ 30-80 , có khả năng hình thành cấu trúc 
bậc II ổn định (duy trì cầu trúc vòng loop RAR - 
repeat and anti-repeat, SL2 - stem loop 2 và SL3 - 
stem loop 3), tổng số cặp bazơ (TBP - total base 
pairs) < 13, số cặp bazơ liên tục (CBP - consecutive 
base pairs) < 8, số cặp bazơ bên trong cấu trúc gRNA 
(IBP-internal base pairs) < 7 [16]. Kết quả phân tích 
bằng phần mềm CRISPR-P v2.0 và Mfold 2.3 cho thấy 
có 15/18 gRNA đảm bảo việc hình thành phức hệ 
CRISPR/CAS9 ổn định có hoạt tính trong nhân tế 
bào thực vật (Bảng 2, Hình 4); trong đó 6 gRNA có 
điểm On-score (điểm đánh giá khả năng hoạt động) 
ở mức cao (0,2 - 0,5) và 12 gRNA có điểm On-score ở 
mức thấp (< 0,2). Đối với đích tác động là PthXo2(A)-
EBE, ba trình tự gRNA-1, gRNA-6 và gRNA-9 có điểm 
On-score (0,3391) và có cùng một vị trí cắt 
(1PthXo2(A)-EBE) (Bảng 2). Tuy nhiên, chỉ gRNA-6 
có Guanine ở đầu 5’- là yếu tố giúp các cấu trúc biểu 
hiện RNA điều khiển bởi promoter U6 hoạt động 
hiệu quả hơn. Đối với đích tác động là vùng mã mở 
đầu trên Exon I, trình tự gRNA-14 và gRNA-15 có 
điểm On-score cao nhất (0,1933 và 0,3765) tương ứng 
với mỗi vị trí cắt (4Exon I và 5Exon I) (Bảng 2) được 
lựa chọn để tiếp tục phân tích. 
Hạn chế lớn nhất của hệ thống chỉnh sửa gen 
CRISPR/CAS9 so với các hệ thống chỉnh sửa gen 
khác (TALEN, ZFN...) đó là tính đặc hiệu của gRNA, 
do gRNA chỉ nhận biết ~20 nucleotide và Cas9 vẫn có 
thể hoạt động dù trình tự DNA đích có một vài 
nucleotide sai khác so với gRNA [4]. Nhằm giảm 
thiểu khả năng nhận biết sai vị trí (off-target) của 
phức hệ CAS9-gRNA, trình tự của các gRNA tiếp tục 
được phân tích bằng phần mềm CCTop 
( để tìm ra các 
đoạn DNA tương đồng với các gRNA có trong hệ gen 
lúa ( Kết quả phân tích 
cho thấy gRNA-6, gRNA-14 và gRNA-15 đều có một 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 26 
số trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa (Bảng 
3. Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ 
gen lúa. Trong khi tất cả các trình tự tương đồng với 
gRNA-6 và gRNA-15 đều nằm cách xa vùng mã hóa 
(Exon) của gen chức năng (Bảng 3); gRNA-14 có 
một trình tự tương đồng nằm trên Exon của một gen 
mã hóa protein nên có khả năng gây ảnh hưởng đến 
hoạt động chức năng của tế bào nếu xảy ra đột biến 
sai vị trí mong muốn (off-target). 
Bảng 3. Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ gen lúa 
Tên Trình tự DNA tương đồng 
Vị 
trí 
Khoảng cách đến 
Exon gần nhất 
Mã số gen đích 
gRNA-6 AGGGAGGAA[TGAAGGGATTTG] 
GGAGGGGAA[TGGAGGGACTTG] 
GAAGAGGAA[AGAAGGGAGGTG] 
I 
I 
- 
492 
68716 
67958 
ENSORLG00000002227 
ENSORLG00000025158 
ENSORLG00000016115 
gRNA-
14 
ATTCTTTT[AGCAAACAAAAA] 
TGCCATTT[AGCAAACAAAAA] 
CCTGTTTT[AGCACACAAAAG] 
CTTCTTAT[AGCACACAAAAT] 
- 
E 
I 
- 
1902 
0 
118 
4839 
EPlOSAG00000044882 
Os07g0239600 
Os12g0636000 
Os03g0248600 
gRNA-
15 
CTTTTTTCA[ATCAAAAATGGC] 
CATTTTGCA[AACAAAAACGGC] 
TTTTTAATA[CACAAAAATGGT] 
- 
- 
- 
15608 
1350 
232 
Os06g0260250 
EPlOSAG00000035043 
Os03g0264075 
Ghi chú: Chữ trong ngoặc [] thể hiện trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) của gRNA; chữ in 
đậm thể hiện vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng trên gRNA. 
Như vậy, tổng hợp các kết quả phân tích dự đoán 
cấu trúc và tính đặc hiệu có thể xác định các gRNA 
có thể sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh 
sửa SW13-BT theo cơ chế ghép nối điểm cuối không 
tương đồng (Non-homologous end joining) [19, 24] 
bằng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 [4], bao 
gồm gRNA-6 chỉnh sửa PthXo2(A)-EBE và gRNA-15 
gây đột biến bất hoạt hoàn toàn OsSWEET13 của 
BT7. Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho nghiên 
cứu chức năng của OsSWEET13 sau này, đồng thời 
phục vụ mục tiêu tạo ra dòng lúa BT7 kháng bệnh 
bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa gen. 
4. KẾT LUẬN 
Promoter/gen SW13-BT liên quan đến quá trình 
xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá Xoo trên giống lúa 
BT7 đã được phân lập và giải trình tự đầy đủ. Vùng 
trình tự đã phân lập chứa PthXo2(A)-EBE và một 
phần Exon I đã được chọn để thiết kế 2 cấu trúc 
gRNA phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen 
SW13-BT bằng công nghệ CRISPR/CAS9. Kết quả 
của nghiên cứu góp phần làm phong phú dữ liệu 
ngân hàng gen lúa Việt Nam đồng thời đặt nền móng 
cho định hướng tăng cường khả năng kháng bệnh 
bạc lá của giống lúa chủ lực BT7 bằng công nghệ 
chỉnh sửa hệ gen. 
LỜI CẢM ƠN 
Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Ứng 
dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trong 
chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá” (2017-2020), 
thuộc Chương trình Công nghệ sinh học Nông 
nghiệp - Thủy sản của Bộ Nông nghiệp và PTNT. 
Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Antony G., Zhou J., Huang S., Li T., Liu B., 
White F., Yang B. (2010). Rice xa13 recessive 
resistance to bacterial blight is defeated by induction 
of the disease susceptibility gene Os11N3. Plant Cell, 
22(11):3864-76. 
2. Blanvillain-Baufumé S., Reschke M., Solé M., 
Auguy F., Doucoure H., Szurek B., Meynard D., 
Portefaix M., Cunnac S., Guiderdoni E., Boch J., 
Koebnik R. (2017). Targeted promoter editing for 
rice resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae 
reveals differential activities for SWEET14-inducing 
TAL effectors. Plant Biotechnol. J., 15(3):306-317. 
3. Boch J., Bonas U. (2010). Xanthomonas 
AvrBs3 family-type III effectors: discovery and 
function. Annu. Rev. Phytopathol., 48:419-36. 
4. Bortesi L., Fischer R. (2015). The 
CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and 
beyond. Biotechnol. Adv., 33(1):41-52. 
5. Chen L. Q., Hou B. H., Lalonde S., Takanaga 
H., Hartung M., Qu X. Q., Guo W. J., Kim J. G., 
Underwood W., Chaudhuri B., Chermak D., Antony 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 27 
G., White F., Somerville S., Mudgett M. B. and 
Frommer W. (2010). Sugar transporters for 
intercellular exchange and nutrition of pathogens. 
Nature, 468: 527-532. 
6. Chen L. Q., Qu X. Q., Hou B. H., Sosso D., 
Osorio S., Fernie A. R., Frommer W. B. (2012). 
Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key 
step for phloem transport. Science, 335(6065):207-11. 
7. Cheng Q., Mao W., Xie W., Liu Q., Cao J., 
Yuan M., Zhang Q., Li X. and Wang S. (2017). 
Characterization of a disease susceptibility locus for 
exploring an efficient way to improve rice resistance 
against bacterial blight. Sci China Life Sci., 60(3): 
298-306. 
8. Chu Z., Yuan M., Yao J., Ge X., Yuan B., Xu 
C., Li X., Fu B., Li Z., Bennetzen J. L., Zhang Q., 
Wang S. (2006). Promoter mutations of an essential 
gene for pollen development result in disease 
resistance in rice. Genes Dev., 20(10):1250-5. 
9. Doyle J. J. and Doyle J. L. (1990). 
Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 
13-15. 
10. Grau J., Wolf A., Reschke M., Bonas U., 
Posch S., Boch J. (2013). Computational predictions 
provide insights into the biology of TAL effector 
target sites. PLoS Comput. Biol., 9(3):e1002962. 
11. Huang S., Antony G., Li T., Liu B., Obasa K., 
Yang B., White F. F. (2016). The broadly effective 
recessive resistance gene xa5 of rice is a virulence 
effector-dependent quantitative trait for bacterial 
blight. Plant J., 86(2):186-94. 
12. Hummel AW., Doyle EL., Bogdanove AJ. 
(2012). Addition of transcription activator-like 
effector binding sites to a pathogen strain-specific 
rice bacterial blight resistance gene makes it 
effective against additional strains and against 
bacterial leaf streak. New Phytol., 195(4):883–893. 
13. Hutin M., Sabot F., Ghesquière A., Koebnik 
R., Szurek B. (2015). A knowledge-based molecular 
screen uncovers a broad spectrum OsSWEET13 
resistance allele to bacterial blight from wild rice. 
Plant J., 84(4):694-703. 
14. Jha G., Ramanan R. and Sonti R. (2007). 
Functional Interplay Between Two Xanthomonas 
oryzae pv. oryzae Secretion Systems in Modulating 
Virulence on Rice. Molecular plant-microbe 
interactions: MPMI, 20: 31-40. 
15. Kay S., Hahn S., Marois E., Wieduwild R., 
Bonas U. (2009). Detailed analysis of the DNA 
recognition motifs of the Xanthomonas type III 
effectors AvrBs3 and AvrBs3Deltarep16. Plant J., 
59(6):859–871. 
16. Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D. (2016). 
Selection of highly efficient scrRNAs for 
CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Sci. Rep., 
6:21451. 
17. Mew T. W. (1987). Current Status and 
Future Prospects of Research on Bacterial Blight of 
Rice. Annual Review of Phytopathology, 25(1): 359-
382. 
18. Nakashima K., Jan A., Todaka D., Maruyama 
K., Goto S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. 
(2014). Comparative functional analysis of six 
drought responsive promoters in transgenic rice. 
Planta, 239(1):47-60. 
19. Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones 
J.D., Kamoun S. (2013). Targeted mutagenesis in the 
model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-
guided endonuclease. Nat. Biotechnol., 31(8):691-
693. 
20. Oliva R., Ji C., Atienza-Grande G., Huguet-
Tapia J. C. And Perez-Quintero A. (2019). Broad-
spectrum resistance to bacterial blight in rice using 
genome editing. 37(11): 1344-1350. 
21. Römer P., Recht S., Lahaye T. (2009). A 
single plant resistance gene promoter engineered to 
recognize multiple TAL effectors from disparate 
pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 
106(48):20526–20531. 
22. Römer P., Strauss T., Hahn S., Scholze H., 
Morbitzer R., Grau J., Bonas U., Lahaye T. ( 2009). 
Recognition of AvrBs3-like proteins is mediated by 
specific binding to promoters of matching pepper 
Bs3 alleles. Plant Physiol. 150(4):1697–1712. 
23. Sambrook J., Russel D. W. (2001). Molecular 
Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring 
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY. 
24. Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang 
J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X., 
Skarnes W. C. (2014). Efficient genome modification 
by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 28 
effects. Nat. Methods, 11(4):399-402. 
25. Smith L. M., Sanders J. Z., Kaiser R. J., 
Hughes P., Dodd C., Connell C. R., Heiner C., Kent 
S. B., Hood L. E. (1986). Fluorescence detection in 
automated DNA sequence analysis. Nature, 
321(6071):674-679. 
26. Streubel J., Pesce C., Hutin M., Koebnik R., 
Boch J., Szurek B. (2013). Five phylogenetically 
close rice SWEET genes confer TAL effector-
mediated susceptibility to Xanthomonas oryzae pv. 
oryzae. New Phytol., 200:808-81. 
27. Zhou J., Peng Z., Long J., Sosso D., Liu B., 
Eom J.-S., Huang S., Liu S., Cruz C., Frommer W., 
White F. and Yang B. (2015). Gene targeting by the 
TAL effector PthXo2 reveals cryptic resistance gene 
for bacterial blight of rice. The Plant journal : for cell 
and molecular biology 82. 
DESIGNING gRNA FOR EDITING PROMOTER OsSWEET13 RELATED TO BACTERIAL 
LEAF BLIGHT DISEASE IN BT7 RICE VARIETY 
Phung Thi Thu Huong, Tran Thi Thanh Huyen, Pham Phuong Ngoc, 
 Cao Le Quyen, Pham Xuan Hoi, Nguyen Duy Phuong* 
Summary 
Bacteria leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is one of the most serious 
diseases in rice. Bac thom 7 (BT7) rice variety is a major rice cultivars in the Northern region of Vietnam, 
but it is susceptible to BLB. OsSWEET13 is a member of the OsSWEET family - which encodes the 
saccrose transport protein, it is involved in the infection mechanism of BLB in plants. In this study, the 
OsSWEET13 promoter was isolated from the total DNA of BT7 rice variety. The results showed that the 
isolated DNA sequence has size of 640 bp, with the similarity of 99.38  and 92.3  for the published 
sequence of OsSWEET13 (AP014968.1) and (CP018168.1) respectively, contains a effector binding element 
(EBE) that reconized by PthXo2 - the type III secretory transcription activator-like (TAL) proteins of the 
Xoo. Based on the isolated DNA sequence, two gRNAs (guide RNA) was designed to edit the EBE 
sequence on the OsSWEET13 promoter and knockouting the OsSWEET14 gene using CRISPR/CAS9 
(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) system aims to 
generate high-yielding rice varieties resistant to BLB in future. 
Keywords: Bacterial leaf blight, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae, Gene 
editing. 
Người phản biện: PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 
Ngày nhận bài: 16/6/2020 
Ngày thông qua phản biện: 16/7/2020 
Ngày duyệt đăng: 23/7/2020