Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả năng phân giải lân, cố định đạm từ đất trồng cà phê tại tỉnh Đắk Lắk

,35 ± 1,88d 
Ghi chú: Trong cùng một ngày, các số trung bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau biểu 
thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD). 
Các dòng vi sinh vật có khả năng phân giải lân 
tăng mạnh từ ngày nuôi cấy thứ 3 và cao nhất vào 
ngày thứ 4, sau đó giảm dần vào ngày thứ 5 trong 
quá trình nuôi cấy (Bảng 2). Việc giảm khả năng 
phân giải lân sau 5 ngày nuôi cấy cho thấy môi 
trường đã cạn kiệt chất dinh dưỡng và bắt đầu xuất 
hiện các chất độc hại ức chế sự sinh trưởng của vi 
sinh vật. 
Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2018) đã 
phân lập được 6 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải 
lân với hàm lượng dao động từ 107,25 mg/L đến 
145,55 mg/L. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và Nguyễn 
Hữu Hiệp (2019) cũng đã phân lập được 9 dòng vi 
khuẩn có khả năng phân giải lân với hàm lượng từ 
191,6 đến 241,3 mg/L. Từ dẫn liệu trên, kết quả 
nghiên cứu đã tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật từ 
vùng đất trồng cà phê ở Đắk Lắk với hiệu quả phân 
giải lân từ 641,13 mg/L đến 790,93 mg/L sau 4 ngày 
nuôi cấy. 
Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của ba 
dòng vi sinh vật trên như sau: dòng QT05 B1 có 
khuẩn lạc tròn đều, trắng mờ, nhầy nhớt, trực khuẩn 
gram âm (Hình 1); dòng EBD1.1 có khuẩn lạc hình 
tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, có chấm 
tròn ở giữa, viền khuẩn lạc đều, trực khuẩn gram âm 
(Hình 2); dòng ER1 F1 có khuẩn lạc tròn, hệ sợi màu 
trắng sinh bào tử màu đen, mọc nhô lên mặt thạch, 
viền khuẩn lạc mỏng, đều; sợi nấm phân nhánh có 
vách ngăn, cuống bào từ dài, thể bọng hình cầu lớn, 
thể bình dạng hình chai, đính bào tử hình cầu, kết 
thành chuỗi (Hình 3). 
3.2. Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả 
năng cố định đạm 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 70 
Hình 4. Định tính khả năng cố định đạm của các 
dòng vi khuẩn 
Từ 73 mẫu đất đã phân lập được 19 dòng vi 
khuẩn có khả năng cố định đạm trên môi trường 
Ashby. Kiểm tra khả năng bắt màu của khuẩn lạc 
trên môi trường Ashby bổ sung 1% Congo đỏ (khuẩn 
lạc chuyển màu xám đến đen), chọn lọc được 9 dòng 
vi khuẩn có khả năng cố định đạm trên đất trồng cà 
phê tại tỉnh Đắk Lắk được phân lập với mật độ đạt từ 
6 x 104 đến 1 x 105 CFU/g. Tiến hành định tính khả 
năng cố định đạm của 9 dòng vi khuẩn phân lập được 
trên môi trường Ashbyl lỏng với thuốc thử Nessler, 
kết quả thu nhận được 3 dòng có khả năng cố định 
đạm mạnh (dựa theo màu sắc của phản ứng tạo màu) 
lần lượt là CF01 K3.1, CF01 K3.2 và QT03 K2 (Hình 
4). 
Kết quả xác định hàm lượng nitơ tổng số và hàm 
lượng đạm amoni (NH4
+) trong dung dịch nuôi cấy 
của 3 dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 và QT03 K2 cho 
thấy, hàm lượng nitơ tổng số từ 57,4 - 86,2 mg/L và 
hàm lượng nitơ dưới dạng amoni (NH4
+) từ 0,8 -1,3 
mg/L (Bảng 3). 
Bảng 3. Hàm lượng nitơ tổng số và nitơ dưới dạng 
amoni (NH4
+) cố định được của các dòng vi sinh vật 
Chủng vi 
sinh vật 
Nitơ (mg/L) N-NH4
+ (mg/L) 
CF01 K3.1 86,2 ± 1,29
c 1,1 ± 0,12d 
CF01 K3.2 69,7 ± 2,52
a 1,3 ± 0,02d 
QT03 K2 57,4 ± 2,66
b 0,8 ± 0,11e 
Ghi chú: Trong cùng một ngày, các số trung 
bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống 
nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê 
ở mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD). 
Như vậy, cả 3 dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 và 
QT03 K2 phân lập được đều cho thấy khả năng tổng 
hợp N-NH4
+ (từ 0,8 - 1,3 mg/L NH4
+) cao hơn so với 
kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và 
Nguyễn Hữu Hiệp (2019) là 0,289 (mg/L NH4
+). 
Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của ba 
dòng vi khuẩn trên, được mô tả như sau: CF01 K3.1 
khuẩn lạc tròn, nhỏ, hơi nhô lên so với mặt thạch, 
màu trắng trong suốt, nhầy nhớt, trực khuẩn gram 
âm (Hình 5); dòng CF01 K3.2 có khuẩn lạc tròn, nhô 
thấp so với thạch, màu vàng, trực khuẩn gram âm 
(Hình 6); dòng QT03 K2 có khuẩn lạc tròn đều, hơi 
vàng, bề mặt bóng nhẵn, nhô thấp so với thạch, trực 
khuẩn gram âm (Hình 7). 
3.3. Định danh các dòng vi sinh vật đã tuyển 
chọn dựa trên dữ liệu phân tử 
Giải trình tự gene vùng ITS1 - 5.8S - ITS2 của vi 
nấm thu được kích thước là 575 bp, có độ tương đồng 
100% với dòng vi nấm trong ngân hàng gene NCBI. 
Trình tự gene vùng 16S của các chủng vi khuẩn với 
kích thước dao động từ 1.406 đến 1.456 bp và có độ 
tương đồng cao, từ 98,95 - 99,93% so với 5 dòng vi 
khuẩn trong ngân hàng gene NCBI (Bảng 4). 
Dòng vi khuẩn Burkholderia ambifaria ngoài 
khả năng phân giải lân đã được chứng minh trong 
nghiên cứu này còn có khả năng phân hủy độc tố 
nấm mốc Fusaricacid và ức chế sự phát triển của 
chủng nấm Fusarium spp. (Simonetti et al., 2018). 
Dòng nấm Aspergillus niger phân lập từ các mẫu đất 
ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã được chứng 
minh có khả năng phân giải lân qua nghiên cứu của 
Chuang et al. (2007) với nồng độ hòa tan AlPO4 dao 
động từ 67,5 đến 237 µg/mL. Một số loài thuộc chi 
Klebsiella cũng đã được phân lập từ tầng sinh quyển 
cây trồng tại Hàn Quốc và được chứng minh là có 
khả năng phân giải lân khó tan với khả năng phân 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 71 
giải Ca3(PO4)2 dao động từ 107,7 đến 126,9 µg/mL 
(Chung et al., 2005). 
Dòng vi khuẩn Rhizobium leguminosarum là 
một trong các dòng vi sinh vật cộng sinh nốt sần cây 
họ đậu phổ biến, ngoài ra chúng còn được tìm thấy ở 
rất nhiều nơi khác nhau và chúng đã xâm chiếm rễ 
cỏ Ba lá trắng (Gutiérrez et al., 2017; Iriarri et al., 
2019). Dòng vi khuẩn Sphingobium yanoikuyae đã 
được chứng minh là có khả năng cố định nitơ trong 
nghiên cứu của Rodrigues et al. (2018) với hai chủng 
có ký hiệu là BU32 và BU92. Đối với dòng vi khuẩn 
Klebsiella pneumoniae, đây là một dòng vi khuẩn đã 
được chứng minh là có khả năng cố định đạm rất tốt 
thông qua rất nhiều nghiên cứu về nó từ việc phân 
lập, tuyển chọn trong nghiên cứu của Shah et al. 
(1986), các nghiên cứu về thay đổi cơ chất molybdate 
ảnh hưởng đến khả năng cố định nitơ của Kahn et al. 
(1982) đến các nghiên cứu về phân tích, giải trình tự 
gen của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cố 
định nitơ trên ruộng mía ở Colombia (Medina-
Cordoba et al., 2019). 
Bảng 4. Kết quả so sánh trình tự tương đồng các dòng vi sinh vật tuyển chọn với cơ sở dữ liệu NCBI 
Vùng bảo thủ dùng để định 
danh 
Kết quả định danh 
Căn cứ định danh Dòng vi 
sinh vật 
Vùng 
Kích thước 
(bp) 
Tên loài 
Mức độ tương 
đồng cao nhất 
(%) 
Mã truy cập 
trên 
Genbank 
QT05 B1 16S-rRNA 1.456 
Burkholderia ambifaria 
(Palleroni and Holmes) 
Coenye et al. 
99,79% với dòng 
MC40-6 
AF311972 
ER1 F1 
ITS1 – 5.8S – 
ITS2 
575 
Aspergillus niger van Tieghem 
100% với dòng 
SPZS49 
KY607770 
EBD1.1 16S-rRNA 1.451 
Klebsiella aerogenes 
(Hormaeche and Edwards) 
Tindall et al. 
99,72% với dòng 
VITMSJ1 
MH100730 
CF01 K3.1 16S-rRNA 1.406 
Rhizobium leguminosarum 
(Frank) Frank (Approved 
Lists) 
99,35% với dòng 
CGAPGPBRS-025 
KY495212 
CF01 K3.2 16S-rRNA 1.452 
Sphingobium yanoikuyae 
Yabuuchi et al. 
99,93% với dòng 
CH 1-1-2 
KM871860 
QT03 K2 16S-rRNA 1.439 
Klebsiella pneumonia 
(Schroeter) Trevisan 
98,95% với dòng 
YJY5 
KP973964 
4. KẾT LUẬN 
Từ 73 mẫu đất trồng cà phê tại tỉnh Đắk Lắk đã 
tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật có khả năng phân 
giải lân khó tan cao, lần lượt là QT05B1 thuộc loài 
Burkholderia ambifaria đạt 790.93 (mg/L), ER1 F1 
thuộc loài Aspergillus niger đạt 667.00 mg/L và 
EBD1.1 thuộc loài Klebsiella aerogenes đạt 641,13 
mg/L sau 96 giờ nuôi cấy. Và 3 dòng vi khuẩn có khả 
năng cố định đạm tốt là CF01 K3.1 thuộc loài 
Rhizobium leguminosarum với hàm lượng nitơ tổng 
số đạt 86,2 mg/L và đạm amoni đạt 1,1 mg/L; CF01 
K3.2 thuộc loài Sphingobium yanoikuyae có hàm 
lượng nitơ tổng số đạt 69,7 mg/L và đạm amoni đạt 
1,3 mg/L và QT03 K2 thuộc loài Klebsiella 
pneumoniae có hàm lượng nitơ tổng số đạt 57,4 
mg/L và đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau 72 giờ nuôi 
cấy. Đây là những chủng vi sinh vật tiềm năng sử 
dụng trong sản xuất cà phê tại Đắk Lắk. 
LỜI CẢM ƠN 
Công trình này là sản phẩm của đề tài “Nghiên 
cứu, ứng dụng vi sinh vật nội sinh và vi sinh vật vùng 
rễ góp phần phát triển cà phê bền vững” do Trường 
Đại học Đà Lạt chủ trì. Các tác giả xin chân thành 
cảm ơn UBND tỉnh Đắk Lắk, Sở Khoa học và Công 
nghệ tỉnh Đắk Lắk đã cung cấp kinh phí nghiên cứu. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Chuang, C. C., Kuo, Y. L., Chao, C. C., Chao, 
W. L., 2007. Solubilization of inorganic phosphates 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 72 
and plant growth promotion by Aspergillus niger. 
Biology and Fertility of Soils, 43(5): 575-584. 
2. Chung, H., Park, M., Madhaiyan, M., 
Seshadri, S., Song, J., Cho, H., Sa, T., 2005. Isolation 
and characterization of phosphate solubilizing 
bacteria from the rhizosphere of crop plants of 
Korea. Soil Biology and Biochemistry, 37 (10): 1970 - 
1974. 
3. Evizal, R., Tohari I. D., Prijambada, I. D., 
Widada J., Widianto D., 2012. Soil Bacterial Diversity 
and Productivity of Coffee - Shade Tree Agro-
ecosystems. Journal Tropical Soils, 17 (2): 181 - 187. 
4. Gardes, M., T. D., 1993. Bruns, ITS primers 
with enhanced specificity for basidiomycetes-
application to the identification of mycorrhizae and 
rusts. Molecular Ecology, 2 (2): 113 - 118. 
5. Gutiérrez, S. P., 2017. Evaluación de rizobios 
para el desarrollo de un inoculante eficiente y 
competitivo de Trifolium repens. Tesisde maestria. 
Montevideo: Udelar. FA. 
6. Irisarri, P., Cardozo, G., Tartaglia, C., Reyno, 
R., Gutiérrez, P., Lattanzi, F. A., Rebuffo, M., Monza, 
J., 2019. Selection of competitive and efficient 
rhizobia strains for white clover. Frontiers in 
microbiology, 10: 768. 
7. Kahn, D., Hawkins, M., Fady, R. R., 1982. 
Nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: 
nitrogenase levels and the effect of added molybdate 
on nitrogenase derepressed under molybdenum 
deprivation. Microbiology, 128 (4): 779 - 787. 
8. Medina - Cordoba, L. K., Chande, A. T., 
Rishishwar, L., Mayer, L. W., Valderrama-Aguirre, L. 
C., Valderrama - Aguirre, A., Gaby, J. C., Kostka, J. 
E., Jordan, I. K., 2019. Genomic characterization and 
computational phenotyping of nitrogen-fixing 
bacteria isolated from Colombian sugarcane fields. 
BioRxiv: 780809. 
9. Muleta D., Assefa F., Borjesson E., Granhall 
U., 2013. Phosphate - solubilizing Rhizobacteria 
associated with Coffea arabica L. in natural coffee 
forests of southwestern Ethiopia. Journal of the Saudi 
Society of Agricultural Sciences, 12: 73 - 84. 
10. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và Nguyễn Hữu 
Hiệp, 2019. Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố 
định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA nội sinh trong 
cây cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex. A. 
Fronehner) trồng tại tỉnh Đắk Lắk. Tạp chí Khoa học 
- Trường Đại học Cần Thơ, 55 (2): 34 - 40. 
11. Nguyễn Thị Thanh Mai, Chu Đức Hà, Phạm 
Phương Thu và Nguyễn Văn Giang, 2018. Phân lập 
tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất 
trồng cà phê tại khu vực Tây Nguyên. Tạp chí Khoa 
học Nông nghiệp. 60 (5): 34 - 38. 
12. Olle, M., Williams, I. H., 2013. Effective 
microorganisms and their influence on vegetable 
production - a review. Journal of Horticultural 
Science and Biotechnology, 88 (4): 380 - 386. 
13. Rodrigures, A. A., Arauro, M. V. F., Soares, 
R. S., Oliveira, B. F. D., Ribeiro, I. D., Sibov, S. T., 
Vieira, J. D. G., 2018. Isolation and prospection of 
diazotrophic rhizobacteria associated with sugarcane 
under organic management. Anais da Academia 
Brasileira de Ciências, 90 (4): 3813 - 3829. 
14. Sadiq, H. M., Jahangir, G. Z., Nasir, I. A., 
Iqtidar, M., Iqbal, M., 2013. Isolation and 
characterization of phosphate - solubilizing bacteria 
from rhizosphere soil. Biotechnology & 
Biotechnological Equipment, 27 (6): 4248 - 4255. 
15. Simonetti, E., Roberts, I. N., Montecchia, M. 
S., Gutierrez - Boem, F. H., Gomez, F. M., Ruiz, J. A., 
2018. A novel Burkholderia ambifaria strain able to 
degrade the mycotoxin fusaric acid and to inhibit 
Fusarium spp. growth. Microbiological Research, 
206: 50 - 59. 
16. Shah, V. K., 1986. Isolation and 
characterization of nitrogenase from Klebsiella 
pneumoniae. Methods in enzymology. Elsevier: 511 – 
519. 
17. TCVN 5988: 1995 (ISO 5664: 1984) về chất 
lượng nước - xác định amoni - phương pháp chưng 
cất và chuẩn độ. 
18. TCVN 8557: 2010 về phân bón - Phương pháp 
xác định nitơ tổng số. 
19. Vatsyayan, N., Ghosh, A. K., 2013. Isolation 
and Characterization of Microbes with Biofertilizer 
Potential. IOSR Journal of Environmental Science, 
Toxicology and Food Technology, 7 (4): 5 - 9. 
20.Vũ Thị Minh Đức., 2001. Thực tập vi sinh vật 
học, Đại học Quốc gia Hà Nội. 
21. Weller, D. M., 1988. Biological control of 
soilborne plant pathogens in the rhizosphere with 
bacteria. Ann. Rev. Phytopathology, 26: 379 - 407. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 73 
22. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., 
1990. Amplification and direct sequencing of fungal 
ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR 
protocols: a guide to methods and applications, 18 
(1): 315 - 322. 
ISOLATION, SELECTION OF PHOSPHATE AND NITROGEN FIXING SOLUBILISING 
RHIZOSPHERE MICROORGANISMS FROM COFFEE CULTIVATED IN DAK LAK PROVINCE 
Nguyen Khoa Truong1, Le Ngoc Trieu1, Nguyen Van Binh1, Nguyen Thi Bich Lien1, 
Phan Trung Truc1, Le Thi Hong1, Tran Van Tien1, Nguyen Hac Hien2 
1Dalat University 
2Department of Cultivation and Plant Protection, Dak Lak province 
Email: truongnk@dlu.edu.vn 
Summary 
The isolation and selection of phosphate and nitrogen-fixing solubilizing rhizosphere microorganism from 
coffee cultivated are necessary, which is the application of biofertilizer to replace inorganic fertilizer. It 
could support high yield and keep a healthy environment. In this study, 30 phosphates and 9 N2-fixing were 
isolated from the rhizosphere of coffee cultivated in Cư Kuin and Cư M’gar district from Dak Lak province. 
Among them, QT05B1 (Burkholderia ambifaria), ER1 F1 (Aspergillus niger) and EBD1.1 (Klebsiella 
aerogenes) were determined to exhibited the highest phosphate solubilization (790.93 (mg/L), 790.93 
(mg/L), 641.13 mg/L; CF01 K3.1 (Rhizobium leguminosarum), CF01 K3.2 (Sphingobium yanoikuyae), 
QT03 K2 (Klebsiella pneumoniae) were determined to exhibited the highest ability of N2-fixing with 86.2 
mg/L of 1.1 mg/L NH4 
+, 69.7 mg/L of 1.3 mg/L NH4 
+ and 57.4 mg/L of 0.8 mg/L NH4 
+ after 72 hours of 
culture. These are potential strains of microorganisms to be used for coffee production in Dak Lak province. 
Keywords: N2-fixing, Dak Lak, phosphate solubilization, microorganisms. 
Người phản biện: PGS.TS. Lê Như Kiểu 
Ngày nhận bài: 9/9/2020 
Ngày thông qua phản biện: 9/10/2020 
Ngày duyệt đăng: 16/10/2020