Phân lập Bacillus spp. có khả năng đối kháng với nấm Aspergillus sp. CDP2, ứng dụng trong xử lý hạt giống đậu phộng

358 
PHÂN LẬP BACILLUS SPP. CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG 
VỚI NẤM ASPERGILLUS SP. CDP2, 
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG 
Trịnh Lai Lợi, Lê Nguyễn Ái Mi, Lâm Minh Khoa, Hồ Anh ơn 
Viện Công nghệ Việt Nhật, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh 
GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương 
TÓM TẮT 
Từ mẫu đậu phộng (rễ và hạt) thu nhận tại xã Hòa Khánh Tây, tỉnh Long An. Đã phân lập và tuyển 
chọn được 11 chủng vi khuẩn có hình que sinh bào tử nghi ngờ các chủng này thuộc chi Bacillus. 
Các chủng được tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh hóa nhằm phân loại dựa vào sự khác biệt 
giữa các đặc điểm sinh hóa của các chủng. 11 chủng đã phân lập được tuyển chọn các chủng có 
khả năng kháng được nấm Aspergillus sp. CDP2 trên môi trường SDA. 
Từ khóa: Aflatoxin, Bacillus, đối kháng, phân lập vi khuẩn, ức chế nấm mốc sinh aflatoxin. 
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 
Aflatoxin là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp độc hại chủ yếu được tổng hợp bởi các loài 
nấm sợi bao gồm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus được hình thành trong điều kiện bảo 
quản và lưu trữ. Aflatoxin B1, B2, G1 và G2 (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) là bốn dẫn xuất chính 
Aflatoxin với AFB1 đã được xác định là chất gây ung thư gan. Hơn nữa hàm lượng Aflatoxin cao 
trong thực phẩm thường xảy ra ở vùng nhiệt đới nơi mà nấm Aspergillus flavus và Aspergillus 
parasiticus phát triển do nhiệt độ và độ ẩm cao, do đó có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. 
Asp. flavus được tìm thấy như là một loài hoại sinh trong đất với quy mô trên toàn thế giới và 
gây ra bệnh trên các mùa vụ nông nghiệp; như là gạo, đậu phộng, và hạt cây bông, trước và 
sau thu hoạch. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy hạt đậu phộng bị nhiễm mốc thường tỷ lệ nảy 
mầm rất thấp. 
Ở thực vật có nhiều loài vi khuẩn góp phần giúp thúc đẩy sự phát triển và bảo vệ. Trong số 20 chi 
của vi khuẩn thì Bacillus spp.; Pseudomonas spp. và Streptomyces spp. được sử dụng rộng rãi như 
các chất diệt khuẩn. Bacillus spp. đã được báo cáo để sản xuất một số hợp chất kháng nấm, thúc 
đẩy tăng trưởng ở thực vật giúp kiểm soát được mầm bệnh và thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật 
vùng rễ (Rhizobacteria). Các peptide kháng nấm được sinh ra bởi các loài Bacillus bao gồm 
mycobacillins, surfactin, mycosubtilins và mushistatins ngoài các enzyme phân hủy vách tế bào 
nấm mốc như chitinase, protease và các enzyme phân hủy vách tế bào khác. Có nhiều báo cáo về 
chi Bacillus có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus trên hạt đậu phộng. 
359 
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1 Vật liệu 
Các chủng vi khuẩn Bacillus sp. được phân lập từ rễ và hạt của cây đậu phộng. 
Chủng nấm mốc chỉ thị thuộc Aspergillus sp. CDP2 phân lập từ hạt đậu phộng mốc được cung cấp 
bởi Khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh. 
2.2 Phương pháp 
2.2.1 Phân lập, xác định các đặc điểm hình thái, sinh hóa và khảo sát khả năng có lợi 
Các chủng Bacillus được phân lập từ mẫu rễ và hạt đậu phộng đã xử lý 80 oC trong 15 phút và cấy 
trang trên môi trường NA ủ trong 24 giờ. Sau đó xác định đặc điểm hình thái, sinh lý và xác định 
các chủng thuộc chi Bacillus theo khóa phân loại của Bergey. Các chủng thuộc chi Bacillus làm 
thuần trên môi trường NA. 
Các chủng đã làm thuần tiến hành làm các đặc điểm sinh hóa: IMViC, nitrate, catalase, thủy phân 
gelatin, oxidase, nuôi cấy bổ sung NaCl 5% và 7%, nuôi cấy ở 42 oC và lên men nguồn các nguồn 
đường [1,2]. 
2.2.2 Phương pháp đối kháng với nấm Aspergillus sp. CDP2 
Các chủng sẽ được khảo sát và tuyển chọn các chủng tốt nhất có khả đối kháng với nấm 
Aspergillus sp. CDP2 với tỷ lệ cao trên môi trường SDA. Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi 
trường NA trong 24 giờ và cấy vào môi trường SDA đã cấy nấm Aspergillus sp. CDP2, sao cho từ 
tâm đ a tới vị trí cấy là 3 cm [3,4]. 
2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 
Các thử nghiệm được xử lý thống kê theo phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA) 
(p<0.05), so sánh trung bình theo phương pháp trắc nghiệm Ducan. Các số liệu ghi nhận được xử lý 
bằng phần mềm Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 21. Số liệu được biểu diễn và 
vẽ đồ thị bằng phần mềm Excel phiên bản office 365. 
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1 Đặc điểm của các chủng Bacillus đã phân lập 
Từ mẫu rễ và hạt đậu phộng đã thu mẫu ở xã Hòa Khánh Tây, tỉnh Long An thì đã phân lập được 11 
chủng vi khuẩn. Các chủng đã phân lập được đều có khuẩn lạc tròn, trắng đục, vài chủng có màu 
xám vàng. Các chủng này đều là gram dương, hình que và sinh bào tử khi quan sát dưới kính hiển 
vi quang học, dương tính với thử nghiệm Catalase, nghi ngờ thuộc chi Bacillus. Bảng 3.1 là những 
kết quả thử nghiệm đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập được. 
360 
Bảng 3.1: Các đặc điểm sinh hóa của các chủng thuộc chi Bacillus 
CHỦNG 
TEST 
A
N
N
K
1
1
A
N
N
K
1
6
N
N
K
2
1
N
N
K
2
3
N
N
K
2
4
N
N
K
2
5
0
4
0
5
-2
R
5
4
D
P
6
2
D
P
6
3
N
D
P
6
1
Gram + + + + + + + + + + + 
Sinh bào tử + + + + + + + + + + + 
Hình dạng tế 
bào 
que que que que que que que que que que que 
Citrate + + + + + + + + + + + 
Methyl-red + + + + + + + + + + + 
Oxidase + + + + + + + + + + + 
Thủy phân 
Gelatin 
+ + + + + + + + + + + 
Catalase + + + + + + + + + + + 
Khử Nitrate + + + + + + + - - + + 
Voges 
Proskauer 
+ + + + + + + + + + + 
Thủy phân tinh 
bột 
+ + + + + + + + + + + 
Indole - - - - - - - - - - - 
NaCl 5% + + + - + - - + + + + 
NaCl 7% + - - - - - - - + + + 
Nuôi cấy 42 oC + + + + + + + + + + + 
Glucose + + + + + + + + + + + 
Lactose + + + + + + + + + + + 
Galactose + + + + + + + + + + + 
Maltose + + + + + + + + + + + 
Sucrose + + + + + + + + + + + 
3.2 Khả năng đối kháng nấm Aspergillus sp. CDP2 với các chủng phân lập được trên 
môi trường SDA 
Các chủng vi khuẩn được tiến hành đối kháng với Aspergillus sp. CDP2 cho thấy, hầu như các 
chủng đều có khả năng đối kháng tốt khi cấy trước 24 giờ. Chủng NNK23 và ANNK16 không có khả 
năng đối kháng với Aspergillus sp. CDP2. Chủng có khả năng đối kháng mạnh nhất là NNK25, 
361 
NNK24 và NDP61. Nhưng khi cấy cùng lúc thì chủng NNK25 không có khả năng đối kháng với 
Aspergillus sp. CDP2 mà DP62 cho kết quả đối kháng tốt nhất. Chủng NNK24 và NDP61 là hai 
chủng cũng cho kết quả đối kháng tốt khi cấy cùng lúc. Từ kết quả nuôi cấy trước 24 giờ và nuôi cấy 
cùng lúc thì NNK24 là chủng cho kết quả đối kháng tốt nhất. Nhìn vào Hình 1 và 2 cho kết quả các 
chủng đối kháng với nấm ổn định khi cấy cùng lúc và cấy trước 24 giờ cho kết quả I%>50% là 
NNK21, NNK24, DP62, DP63, NDP61. 
Hình 1: A) Tỷ lệ đối kháng với Aspergillus sp. CDP2 (Cấy vi khuẩn trước 24 giờ). 
B) Tỷ lệ đối kháng với Aspergillus sp. CDP2 (Cấy cùng lúc) 
Hình 2: Đối kháng cấy vi khuẩn trước 24 giờ sau đó cấy Aspergillus sp. CDP2 trên môi trường SDA (A, B, C); 
Đối kháng cấy vi khuẩn và nấm cùng lúc trên môi trường SDA (D, E, F), trong đó, (A, D): Đối chứng âm; (B, E): 
Bacillus sp. NNK24; (C, F): Đối chứng dương (Cruise plus 312.5fs). 
362 
4 KẾT LUẬN 
Mười một chủng phân lập được tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh 
hóa của chi Bacillus. Sau đó các chủng được tiến hành đối kháng với Aspergillus sp. CDP2 trên môi 
trường SDA trong 96 giờ. Các chủng cho kết quả đối kháng ổn định I%>50% khi đối kháng cùng lúc 
và cấy khuẩn trước 24 giờ là NNK21, NNK24, DP62, DP63, NDP61. Trong đó chủng đối kháng ổn 
định có tỷ lệ đối kháng cao nhất là NNK24. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Nguyễn Lân Dũng. Giáo trình Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 
[2] May A.A.Al-Allaf (2011) Isolation of Bacillus spp. from some sources and study of its proteolytic 
activity. ISSN: 1813 – 1662. 
[3] Phạm Hoàng Nhân (2018). Sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý hạt giống từ Bacillus spp. 
Luận văn Thạc s . Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (HUTECH). 
[4] Xiaoshuang Xia, Betchem Garba, Hongyin Zhang, Mingyan Li, Peiwu Li, Qi Zhang, Ye Zhang, 
Yun Wang, (2017). Isolation and characterization of a Bacillus subtilis strain with aflatoxin B1 
biodegradation capability. Food Control 75 (2017) 92e98.