Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch phục vụ công tác phân loại và nhận dạng các giống na dai (Annona squamosa) tại Thái Nguyên

 rãi để xây dựng mối 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 21 
quan hệ các hệ sinh thái giữa các loài có liên quan 
chặt chẽ hoặc để định danh các loài thực vật 
(Taberlet et al., 2007). Đoạn gen trnL-trnF được 
khuếch đại thành công ở tất cả 36 mẫu Na nghiên 
cứu (Hình 3), các băng ADN thu được đều sáng và 
rõ, chỉ xuất hiện một băng ADN duy nhất với kích 
thước khoảng trên 500 bp (khi so sánh với thang 
ADN chuẩn 100 bp). 
Các trình tự trnL-trnF sau khi nhân bản sẽ được 
tinh sạch và xác định trình tự nucleotide. Việc giải 
trình tự nucleotide là một bước rất quan trọng để 
khẳng định được sự tương đồng về di truyền giữa các 
mẫu Na dai nghiên cứu. 
3.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các 
đoạn mồi khác nhau 
3.3.1. Trình tự nucleotide đoạn gen matK 
Kết quả xác định trình tự nucleotide đoạn matK 
ở 36 mẫu Na dai cho thấy đoạn gen được nhân bản 
có kích thước 820 bp. Sau khi xử lý trình tự 
nucleotide bằng phần mềm BioEdit thì chỉ một đoạn 
gen có kích thước 800 bp có chất lượng giải trình tự 
tốt, đoạn đầu và đoạn cuối của gen bị nhiễu nên được 
loại bỏ để quá trình phân tích trình tự được chính 
xác. 
Hình 4. So sánh trình tự đoạn gen matK của các mẫu Na dai tại tỉnh Thái Nguyên với các trình tự tương đồng 
trên Ngân hàng Gen quốc tế 
Tất cả 36 trình tự đoạn gen matK đều được so 
sánh với nhau và kết quả cho thấy độ tương đồng là 
100%, tức là đoạn gen matK có trình tự nucleotide rất 
bảo thủ ở tất cả các mẫu Na dai tại Thái Nguyên. Với 
kết quả giống nhau về trình tự này, đã lựa chọn trình 
tự nucleotide của mẫu N1.1 là trình tự đại diện cho 
tất cả 36 mẫu Na dai tại tỉnh Thái Nguyên để so sánh 
với các trình tự tương đồng trên Ngân hàng Gen 
quốc tế. 5 trình tự tương đồng của 5 loài thuộc chi 
Annona được lựa chọn để so sánh sự khác biệt về 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 22 
trình tự nucleotide với trình tự matK của mẫu N1.1, 
sự sai khác giữa 6 trình tự được thể hiện trên hình 4. 
Hình 4 cho thấy trình tự matK của mẫu N1.1 
tương đồng 100% với trình tự matK của loài A. 
squamosa (mã số EU715064.1) và tương đồng trên 
99% (99,37% - 99,62%) với 4 loài khác cùng thuộc chi 
Annona. Vị trí nucleotide sai khác của mẫu N1.1 so 
với 4 loài thuộc chi Annona là 7 vị trí, trong đó có 2 vị 
trí khác biệt thể hiện rõ ràng giữa loài A. squamosa 
và mẫu N1.1 so với 4 loài còn lại là vị trí số 135 (mẫu 
N1.1 và A. squamosa là nucleotide loại C thì 4 loài 
còn lại là A) và vị trí 408 (mẫu N1.1 và loài A. 
squamosa là nucleotide loại G thì 4 loài còn lại là T). 
Kết quả phân tích trình tự nucleotide này cho thấy: 
trình tự nucleotide của đoạn matK không bị biến đổi 
bên trong loài A. squamosa và có sự sai khác nhỏ với 
các loài trong cùng một chi, trình tự đoạn gen matK 
là một chỉ thị ADN mã vạch hiệu quả để định danh 
và giám định loài A. squamosa và tất cả 36 mẫu Na 
dai trồng tại tỉnh Thái Nguyên đều là loài A. 
squamosa. Kết luận này được thể hiện rõ ràng hơn 
trên cây quan hệ di truyền ở hình 7. 
Larranaga và Hormaza (2015) đã phát triển chỉ 
thị matK và rbcL cho 7 loài họ hàng gần thuộc chi 
Annona (A. cherimola, A. reticulata, A. squamosa, A. 
muricata, A. macroprophyllata, A. glabra và A. 
purpurea) cho thấy trình tự matK có thể phân biệt 
chính xác được tất cả 7 loài và mức độ đa dạng về 
trình tự nucleotide trong loài thấp so với giữa các 
loài. Trình tự matK cũng được Sangeethe et al. 
(2018) sử dụng để giám định loài A. reticulata phân 
bố ở các vùng địa lý khác nhau, kết quả cũng cho 
thấy việc sử dụng chỉ thị matK có thể giám định 
chính xác loài và cũng có thể xác định được các mức 
độ đa dạng di truyền. Đối với 36 mẫu Na dai tại Thái 
Nguyên, trình tự đoạn gen matK lại có độ tương 
đồng tuyệt đối (100%), điều này phù hợp với nhiều 
nghiên cứu đã chỉ ra rằng trình tự gen matK là trình 
tự gen lục lạp rất bảo thủ ở cấp độ loài. 
3.3.2. Trình tự nucleotide đoạn gen trnL-trnF 
Hình 5. Trình tự nucleotide của đoạn gen trnL-trnF ở 36 mẫu Na dai tại tỉnh Thái Nguyên 
Ký hiệu mẫu được thể hiện theo thứ tự mẫu trong bảng 1 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 23 
Kết quả giải trình tự nucleotide của đoạn gen 
trnL-trnF ở 36 mẫu Na dai cho thấy, đoạn gen trnL-
trnF được nhân bản có kích thước từ 520 bp đến 545 
bp. Tuy nhiên, do chất lượng đọc trình tự ở hai đầu 
của đoạn gen không được tốt nên đoạn đầu và đoạn 
cuối của các trình tự sẽ được loại bỏ trước khi tiến 
hành so sánh các trình tự với nhau để đảm bảo kết 
quả so sánh được chính xác. Do đó, trình tự đoạn 
gen trnL-trnF sau khi loại bỏ đoạn đầu và đoạn cuối 
có kích thước 487 bp. 
Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh 36 đoạn 
trình tự gen trnL-trnF cho thấy nửa đầu của đoạn gen 
rất bảo thủ, toàn bộ 248 nucleotide đầu tiên của tất cả 
36 trình tự đều giống nhau 100%, sự khác biệt về 
trình tự nucleotide được thể hiện tương đối lớn ở nửa 
sau của đoạn gen trnL-trnF (Hình 5). Trong đó, 12 
mẫu Na dai tại huyện Võ Nhai, 6 mẫu Na dai tại 
huyện Phú Lương và 6 mẫu Na dai tại huyện Đại Từ 
có trình tự đoạn gen trnL-trnF tương đồng nhau 
100%, các mẫu Na dai ở huyện Phú Bình và Đồng Hỷ 
có sự sai khác tương đối ít. Đặc biệt, sự sai khác về 
trình tự nucleotide thể hiện rất rõ ràng tại 8 vị trí 
nucleotide (vùng đóng khung trong hình 5) ở 12 mẫu 
Na dai tại Võ Nhai so với các mẫu Na dai tại các 
huyện khác. Điều này khẳng định trình tự đoạn gen 
trnL-trnF có khả năng phân biệt được các giống Na 
dai khác nhau, trong đó trình tự trnL-trnF của Na dai 
Võ Nhai là đặc trưng cho giống và phân biệt với các 
giống Na dai khác tại tỉnh Thái Nguyên. 
Để có thể khẳng định trình tự nucleotide đoạn 
gen trnL-trnF của giống Na dai Võ Nhai là đặc hữu, 
đã tiến hành phân tích thêm trình tự nucleotide đoạn 
gen trnL-trnF ở 3 mẫu Na bở tại Võ Nhai. Kết quả 
cho thấy trình tự của 2 giống Na này có sự sai khác 
nhau tại 21 vị trí nucleotide (Hình 6). Trong đó, tất cả 
3 mẫu Na bở tại huyện Võ Nhai có trình tự đoạn gen 
trnL-trnF giống nhau 100% (N19.1, N19.2, N19.3) và 
giống 95,7% so với giống Na dai tại huyện Võ Nhai. 
Hình 6. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL-trnF ở mẫu Na dai và Na bở tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái 
Nguyên 
N10.1: mẫu Na dai; N19.1-N19.3: 03 mẫu Na bở 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 24 
3.4. Xây dựng cây quan hệ di truyền giữa các 
mẫu Na dai tại tỉnh Thái Nguyên 
Hình 7. Cây quan hệ di truyền của Na dai tại tỉnh 
Thái Nguyên với các loài tương đồng trên Ngân hàng 
Gen quốc tế 
Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên 
mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của đoạn 
gen matK ở mẫu Na dai N1.1 với 5 trình tự của 5 loài 
thuộc chi Annona được thể hiện trên hình 7 với độ tin 
cậy đạt 100%. Mẫu N1.1 tương đồng 100% (khoảng 
cách di truyền bằng 0) với loài A. squamosa và tương 
đồng cao với nhóm gồm hai loài A. liebmanniana và 
A. sclerophylla, loài A. cherimola và A. reticulata. Kết 
quả này một lần nữa khẳng định trình tự matK là 
trình tự giám định loài A. squamosa hiệu quả. 
Mức độ tương đồng của các trình tự trnL-trnF ở 
36 mẫu Na dai tại tỉnh Thái Nguyên thể hiện mối 
quan hệ di truyền của các mẫu với nhau (Hình 8), 
trong đó các mẫu thuộc huyện Võ Nhai, Phú Lương, 
Đại Từ được nhóm thành một nhóm, trong nhóm này 
còn có 2 mẫu của huyện Đồng Hỷ (N2.1 và N2.2). 
Nhóm thứ hai bao gồm các mẫu thuộc huyện Đồng 
Hỷ và Phú Bình. 
Trong địa bàn tỉnh Thái Nguyên có nhiều huyện 
trồng Na, nhưng diện tích trồng Na vẫn tập trung 
nhiều nhất ở huyện Võ Nhai và qua nhiều năm cho 
thấy chất lượng Na dai trồng tại huyện Võ Nhai ngon 
hơn so với các địa phương khác. Kết quả phân tích 
trình tự đoạn gen trnL-trnF cũng thể hiện sự sai khác 
rõ ràng giữa giống Na dai tại huyện Võ Nhai so với 
các giống Na dai khác. Từ các kết quả này có thể kết 
luận giống Na dai tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái 
Nguyên là giống đặc hữu với trình tự đoạn gen trnL-
trnF khác với các mẫu Na dai tại các huyện khác của 
tỉnh Thái Nguyên và khác với các mẫu Na bở tại Võ 
Nhai. Trình tự đoạn gen trnL-trnF của cả mẫu Na dai 
và Na bở tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên được 
đăng ký lên Ngân hàng Gen quốc tế (mã số 
MT947750 và MT947749) nhằm mục đích đăng ký 
bảo hộ sản phẩm nông sản đặc sản địa phương. 
Hình 8. Cây quan hệ di truyền của 36 mẫu Na dai tại 
tỉnh Thái Nguyên dựa trên trình tự nucleotide đoạn 
gen trnL-trnF 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 25 
4. KẾT LUẬN 
 Đã xác định được 2 đoạn trình tự ADN mã vạch 
phục vụ phân loại và nhận dạng một số giống Na dai 
tại Thái Nguyên. Trong đó đoạn trình tự matK có 
kích thước đoạn gen nhân bản là 820 bp và trình tự 
nucleotide đoạn gen matK ở tất cả các mẫu Na dai 
nghiên cứu có độ tương đồng 100% và được đăng ký 
trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số MT947748. 
Đoạn trình tự trnL-trnF có kích thước đoạn gen nhân 
bản dao động từ 520 bp đến 545 bp và có sự khác biệt 
giữa các mẫu Na dai tại các huyện khác nhau của 
tỉnh Thái Nguyên. Trong đó, 12 mẫu Na dai của 
huyện Võ Nhai tương đồng 100% về trình tự đoạn gen 
trnL-trnF nhưng lại sai khác với tất cả các mẫu Na dai 
tại 4 huyện còn lại. Mặt khác, Na dai tại huyện Võ 
Nhai có sự sai khác tại 21 vị trí với trình tự nucleotide 
của đoạn gen trnL-trnF ở giống Na bở huyện Võ 
Nhai. Cả hai trình tự đoạn gen trnL-trnF được đăng 
ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số lần lượt là 
MT947750, MT947749. Chỉ thị matK là chỉ thị phục 
vụ giám định hiệu quả loài Na dai với tên khoa học là 
A. squamosa, còn chỉ thị trnL-trnF có thể dùng để 
phân biệt giữa các giống Na khác nhau. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Chatrou L., Pirie M. D., Erkens R. H. J., 
Couvreur T. L. P., Neubig K., Abbott J. R., Mols J., 
Maas J. W., Saunders R. M. K., Chase M. W. (2012). 
A new subfamilial and tribal classification of the 
pantropical flowering plant family Annonaceae 
informed by molecular phylogenetics. Bot J Linnn 
Soc (169), pp 5-40. 
2. FAO (1990). Utilization of Tropical Food, 
Fruits and leaves. FAO Food and Nutrition paper, 47 
(7): 44 – 53. 
3. Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Phong (2015). 
Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam 
đảo (Camellia tamdaoensis): loài cây đặc hữu của 
Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 5, pp 123-
130. 
4. Larranaga N. and Hormaza J. I. (2015). DNA 
barcoding of perennial fruit tree species of 
agronomic interest in the 
genus Annona (Annonaceae), Frontiers in Plant 
Science, 6, pp 589. 
5. Lizana L. A. and Reginato G (1990). 
“Cherimoya” In: Fruits of Tropical and Subtropical 
Origin: Composition, Properties and Uses. Edited by 
S. Nagy, Shaw P. E, Lake Alfrea, Florida, USA, pp 
131-148. 
6. Mishara A, Sing J. N and Jha O. P (1997). Post 
Cotial Antifertility Activi of Anonacese in Italy. 
Mesfin Newletter, 3 (1), pp 11-12. 
7. R. Nagori, P. Sharma, N. Habibi, S. D. Purohit 
(2014). An Efficient Genomic DNA Extraction 
Protocol for Molecular Analysis in Annona reticulata. 
National Academy Science letters, 37, pp 137 - 140. 
8. Pinto A. C. de Q, Cordeiro M. C. R, Andrade 
S. R. M de, Fereira F. R, Kinpara D. I. (2005). 
“Annona species”, International Center for 
Underuilised, University of Southampton, 
Southampton, SO17 1BJ, UK, 3 - 40. 
9. Saghai - Maroof M. A, Soliman K. M, 
Jorgensen R. A, Allard R. W. (1984). Ribosomal 
DNAsepacer-length polymorphism in barley: 
mendelian inheritance, chromosomal location, and 
population dynamics. Proc Natl Acad Sci 81, pp 8014 - 
8019. 
10. Sangeetha V. S., Johns A. E., Lawrence B. 
(2018). DNA barcoding and sequence analysis of 
Annona reticulata Linn. Research & Reviews: Journal 
of Herbal Science, 7 (3), pp. 24-32. 
11. Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., 
Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., 
Christian B., and Eske W. (2007). Power and 
limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for 
plant DNA barcoding. Nucleic Acids Res, 35 (3), pp 
14. 
12. Vijayan K. and Tsou C. H. (2010). DNA 
barcoding in plants: taxonomy in a new 
perspective. Current science, 99, pp. 1530 - 1540. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 11/2020 26 
STUDY ON DETERMINING SEVERAL DNA BARCODE SEQUENCES FOR 
CLASSIFICATION AND IDENTIFICATION OF SUGAR APPLE VARIETIES (Annona 
squamosa) IN THAI NGUYEN PROVINCE 
Ha Bich Hong1 , Nguyen Thi Huyen1, Bui Van Thang1 
Phung Thi Kim Cuc2, Vu Thi Nguyen3 
1College of Forest Biotechnology,Vietnam National University of Forestry 
2Thai Nguyen Green Agriculture Development and Construction Limited Liability Company 
3Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry 
Summary 
Sugar apple (Annona squamosa) is an agricultural crop of economic value in Thai Nguyen province, 
especially sugar apple planted in Vo Nhai district. However, sugar apple in Vo Nhai still faces some 
difficulties: seedlings are limited, people mainly extract branches or choose large seeds for breeding, poor 
farming techniques, roads have not been well improved, has not built a brand to compete with other 
products as well as products of the same type. The Annona genus species have many unified characteristics, 
especially regarding tree height, root system, bark, flower and fruit characteristics. Therefore, the study to 
identify some DNA barcode markers for the specialty Vo Nhai sugar apple variety of Thai Nguyen province 
is essential for the conservation and development of the sugar apple genome, as well as for identification, 
traceability and copyright registration of seedlings and their products. The study has identified two DNA 
barcode sequences, matK and trnL-trnF, serving the identification and analysis of genetic diversity among 
Na dai varieties in Thai Nguyen province. With the matK gene sequence, all sugar apple samples collected 
in Thai Nguyen province have 100% similarity (accession number on gene bank: MT947750) and 100% 
similarity with that of Annona squamosa on international gene bank. For the trnL-trnF sequence, the sugar 
apple samples in Vo Nhai district have the same sequence but differentiate them from the sugar apple 
varieties grown in other districts of Thai Nguyen province. In addition, the trnL-trnF gene fragment 
sequence also helps to distinguish relatively clearly between two genotypes of sugar apple, currently being 
grown in Vo Nhai district (accession numbers on gene bank, respectively: MT947748, MT947749). These 
results are the scientific basis for the conservation and effective exploitation of Vietnam's native Annona 
squamosa genetic resources. 
Keywords: matK, trnL-trnF, DNA barcodes, sugar apple, Annona squamosa. 
Người phản biện: PGS.TS. Khuất Hữu Trung 
Ngày nhận bài: 11/9/2020 
Ngày thông qua phản biện: 12/10/2020 
Ngày duyệt đăng: 19/10/2020