Nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng một số giống quýt bản địa của Việt Nam dựa trên trình tự ITS hệ gen nhân

Bắc Kạn Ba Bể, Bắc Kạn Q14 
- Cặp mồi ITS1/ITS4 
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATT
GATATGC) (Vilgalys R. et al., 1994). 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
- Mẫu lá được thu thập và tách chiết ADN tổng 
số theo phương pháp CTAB của Doyle JJ at el. (1990) 
có cải tiến và kiểm tra nồng độ bằng phương pháp 
điện di gel agarose 1%. 
- Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 
96 well Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 
µl, bao gồm: 5 µl ADN; 0,15 µM mồi; 0,2 mM dNTPs; 
1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 U Taq 
polymerase. Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm: 
94C (5 phút), 36 chu kỳ [94C (1 phút), 56C (45 
giây), 72C (50 giây)] và kết thúc ở 72C (7 phút), 
giữ ở 4C. 
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 
1,5% sử dụng đệm TAE. Gel được nhuộm ethidium 
bromide 0,5 mg/ml và soi trên máy Alpha Imager 
1220 (Alpha Innotech, CA, USA). 
- Sản phẩm PCR được thôi gel theo qui trình 
hướng dẫn của bộ kit Qiagen; 
- Giải trình tự: Sản phẩm PCR sau khi được tinh 
sạch, được giải trình tự tại Công ty Apical Scientific 
(Malaysia). 
- Phương pháp xử lí số liệu: Kết quả giải trình tự 
được so sánh với trình tự tham chiếu trên NCBI và 
được phân tích bằng chương trình MEGA v6.06. 
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. Kết quả giải trình tự vùng ITS 
Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 14 
mẫu/giống quýt nghiên cứu với cặp mồi ITS1/ITS4 
Q1-Q14: Các mẫu/giống quýt bản địa ở bảng 1; 
M: Marker generuler 100 bp plus DNA 
Các mẫu/giống quýt được thu thập tại các 
tỉnh/thành: Đồng Tháp, Thừa Thiên - Huế, Hà 
Giang, Bắc Kạn, Yên Bái, Phú Thọ, Tuyên Quang, 
1.000 bp 
500 bp 
bp 
o bp 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 5 
Sơn La, Lạng Sơn và Hà Nội được tách chiết ADN và 
đưa về nồng độ 50 ng/µl để tiến hành thực hiện phản 
ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4. Kết quả điện di sản 
phẩm PCR cho thấy các mẫu quýt nghiên cứu đều 
cho băng đơn hình với kích thước khoảng 750 bp 
(Hình 1). 
Bảng 2. Đánh giá mức độ tương đồng và độ bao phủ về trình tự DNA vùng ITS của các mẫu/giống quýt 
nghiên cứu so với gen tham chiếu đã công bố trên NCBI 
TT Tên giống Kí hiệu Trình tự tham chiếu 
Độ tương 
đồng (%) 
Độ bao phủ 
(%) 
1 Quýt đường Q1 MH712728.1_Citrus_reticulata 97,10 97,00 
2 Quýt Chiềng Cọ Q2 MH712728.1_Citrus_reticulata 96,96 97,00 
3 
Quýt hồng (Tiều 
Sơn) 
Q3 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,59 97,00 
4 Quýt Tích Giang Q4 MH712728.1_Citrus_reticulata 95,03 97,00 
5 Quýt Hương Cần Q5 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,45 97,00 
6 Quýt Tràng Định Q6 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,59 97,00 
7 Quýt lửa Q7 MH712728.1_Citrus_reticulata 96,55 97,00 
8 Quýt Đông Khê Q8 MH712728.1_Citrus_reticulata 96,44 97,00 
9 Quýt đỏ Ngọc Hội Q9 MH712728.1_Citrus_reticulata 94,00 96,00 
10 Quýt Chum Q10 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,59 97,00 
11 Quýt Hôi Q11 MH712728.1_Citrus_reticulata 97,41 97,00 
12 Quýt ngọt Hà Giang Q12 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,31 97,00 
13 Quýt Bộp Q13 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,45 97,00 
14 Quýt Bắc Kạn Q14 MH712728.1_Citrus_reticulata 99,59 97,00 
Các đoạn trình tự ITS của 14 mẫu/giống quýt 
nghiên cứu được so sánh mức độ tương đồng với các 
trình tự tham chiếu đã công bố trên NCBI sử dụng 
chương trình BLAST. Kết quả phân tích cho thấy độ 
tương đồng về trình tự của các mẫu/giống quýt so 
với gen tham chiếu dao động từ 94,00% đến 99,59% 
với độ bao phủ dao động từ 96 - 97%. Trong đó 
mẫu/giống quýt đỏ Ngọc Hội có mức độ tương đồng 
về trình tự so với gen tham chiếu thấp nhất là 94%. 
Các mẫu/giống quýt hồng (Tiểu Sơn), quýt Tràng 
Định, quýt Chum và quýt Bắc Kạn có mức độ tương 
đồng về trình tự so với gen tham chiếu cao nhất là 
99,59%. Điều này cho thấy các trình tự vùng ITS 
khuếch đại của một số mẫu/giống quýt nghiên cứu 
có mức độ tương đồng cao so với trình tự đã được 
công bố trên NCBI. 
3.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền các 
mẫu/giống quýt nghiên cứu 
Kết quả phân tích các trình tự thông qua phần 
mềm MEGA v6.06 thu được số liệu ở bảng 3 cho thấy 
có hệ số tương đồng di truyền của 14 mẫu/giống 
quýt nghiên cứu dao động từ 93,59 - 99,73%. Hệ số 
tương đồng di truyền thấp nhất là 93,59% giữa 
mẫu/giống Q3 và Q9. Hệ số tương đồng di truyền 
cao nhất là 99,73% giữa mẫu/giống Q3 và Q10, giữa 
các mẫu/giống Q10 - Q13 - Q14. 
Dựa vào kết quả phân tích trình tự DNA vùng 
ITS cho thấy 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu được 
phân thành 4 nhóm (Hình 2, bảng 3). 
Hình 2. Cây phát sinh chủng loại vùng gen ITS của 
14 mẫu/giống quýt nghiên cứu và gen tham chiếu 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 6 
Bảng 3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu và gen tham chiếu 
 Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 Q11 Q12 Q13 Q14 MH7 
Q1 
Q2 99,18 
Q3 96,86 96,86 
Q4 97,26 97,26 95,09 
Q5 97,13 97,13 99,45 95,08 
Q6 96,59 96,86 99,32 94,82 99,05 
Q7 99,04 98,77 96,59 97,67 96,58 96,45 
Q8 95,08 95,35 96,73 93,97 96,99 96,58 95,21 
Q9 94,79 95,07 93,59 96,02 93,85 93,72 95,61 93,83 
Q10 96,86 97,14 99,73 95,09 99,45 99,45 96,45 96,86 93,72 
Q11 96,72 96,99 99,32 94,95 99,32 99,05 96,31 96,72 93,58 99,59 
Q12 96,72 96,99 99,45 94,95 99,18 99,32 96,58 96,99 93,84 99,59 99,18 
Q13 96,59 96,86 99,59 94,82 99,32 99,45 96,45 96,86 93,72 99,73 99,32 99,59 
Q14 96,59 96,86 99,59 94,82 99,32 99,45 96,45 96,86 93,72 99,73 99,32 99,59 99,73 
MH7 95,09 94,95 97,68 93,04 97,54 97,68 94,67 94,95 91,8 97,68 97,27 97,54 97,68 97,81 
Nhóm thứ nhất (nhóm I) gồm một mẫu duy nhất 
là giống quýt đỏ Ngọc Hội (Q9). Dựa vào trình tự 
nucleotide cũng cho thấy mẫu/giống Q9 có sự đa 
hình nucleotide so với gen tham chiếu; mẫu/giống 
Q9 có hệ số tương đồng di truyền so với gen tham 
chiếu là 91,80%. 
Nhóm thứ hai (nhóm II) gồm 8 mẫu/giống quýt 
là Q3, Q5, Q6, Q10, Q11, Q12, Q13, Q14 và gen tham 
chiếu MH721728.1 Citrus reticulata. Các mẫu/giống 
trong nhóm I có hệ số tương đồng di truyền cao dao 
động từ 99,05% (mẫu/giống Q6 với Q5 và Q11) đến 
99,73% (mẫu/giống Q3 và Q10, các cặp mẫu/giống 
Q10 - Q13 - Q14). Hệ số tương đồng di truyền giữa 
các mẫu/giống quýt trong nhóm với mẫu tham chiếu 
MH712728.1_Citrusreticulata dao động từ 97,27 % 
(Q11) đến 97,81% (Q14). 
Nhóm thứ ba (nhóm III) cũng có duy nhất giống 
quýt Đông Khê (Q8), mẫu/giống này có hệ số tương 
đồng di truyền so với các mẫu/giống thuộc nhóm 
khác dao động từ 93,83% (Q8-Q9) đến 96,99% (Q8-
Q12, Q5-Q8) và với gen tham chiếu là 94,95%; 
Nhóm thứ tư (nhóm IV) gồm 4 mẫu/giống là 
Q1, Q2, Q4 và Q7. Các mẫu/giống trong nhóm IV có 
hệ số tương đồng di truyền cao dao động từ 97,26% 
(Q1-Q4, Q2-Q4) đến 99,18% (Q1-Q2) và với gen tham 
chiếu dao động từ 93,04% (Q4) đến 95,09% (Q1). 
3.3. Kết quả nhận dạng một số mẫu/giống quýt 
nghiên cứu 
Kết quả so sánh trình tự của 14 mẫu/giống quýt 
nghiên cứu với trình tự gen tham chiếu đã công bố 
trên NCBI thông qua phần mềm MEGA v6.06 thu 
được ở hình 3 cho thấy: do có sự mất đoạn hay thêm 
đoạn ở một số vị trí trên đoạn gen nên số lượng 
nucleotide tổng số của mỗi đoạn trình tự khác nhau 
giữa 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu. Chiều dài vùng 
ITS của 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu dao động từ 
719 nucleotide đến 734 nucleotide. Vùng ITS có sự 
đa hình trong trình tự nucleotide rất cao với 74 vị trí 
sai khác giữa các mẫu/giống nghiên cứu và gen 
tham chiếu. Trong đó, sáu mẫu/giống quýt Tích 
Giang (Q4), quýt Hương Cần (Q5), quýt đỏ Ngọc Hội 
(Q9), quýt Hôi (Q11), quýt ngọt Hà Giang (Q12) và 
quýt Bộp (Q13) có sự biến đổi nucleotide khác biệt 
so với các mẫu/giống còn lại và gen tham chiếu 
MH721728.1 Citrus reticulata (Bảng 4). 
Mẫu/giống quýt Tích Giang (Q4) có sự thay thế 
các nucleotide C, C, G thành A ở các vị trí 635, 680 và 
690 tương ứng. Tuy nhiên ở 2 vị trí 680 và 690, chỉ có 
duy nhất mẫu/giống quýt Tích Giang có sự thay thế 
các nucleotide C, G thành A khác biệt so với gen 
tham chiếu và mẫu/giống khác trong tập đoàn 
nghiên cứu, vì vậy mẫu quýt này có thể được nhận 
dạng chính xác nhờ sự khác biệt này. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 7 
Bảng 4. Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu/giống quýt nghiên cứu so với gen tham chiếu 
đã công bố trên NCBI 
Hình 3. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng ITS sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 của các mẫu/giống quýt 
nghiên cứu so với gen tham chiếu 
Mẫu/giống quýt Hương Cần (Q5) có sự thay thế 
nucleotide G thành A ở vị trí 99 giống như gen tham 
chiếu MH721728.1 Citrus reticulata và C thành T ở vị 
trí 119 khác so với gen tham chiếu và 13 mẫu/giống 
nghiên cứu còn lại. Mẫu/giống quýt Hương Cần có 
thể được nhận dạng chính xác nhờ sự sai khác này. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 8 
Mẫu/giống quýt Đông Khê (Q8) có thể được 
nhận dạng nhờ sự sai khác so với gen tham chiếu và 
mẫu/giống nghiên cứu ở vị trí 628 và 714. Ở hai vị trí 
này có sự thay thế các nucleotide A thành T và G 
thành C tương ứng. 
Mẫu/giống quýt đỏ Ngọc Hội (Q9) có sự thay 
thế các nucleotide T, G thành C và A ở vị trí 638 và 
714 tương ứng. Vì vậy chỉ có thể nhận dạng chính 
xác mẫu/giống quýt đỏ Ngọc Hội nhờ sự khác biệt 
này so với các mẫu/giống khác trong tập đoàn 
nghiên cứu. 
Mẫu/giống quýt Hôi (Q11) có sự thay thế các 
nucleotide A, C thành G lần lượt ở 2 vị trí 37 và 212, 
khác biệt so với các mẫu/giống khác trong tập đoàn 
nghiên cứu, vì vậy có thể nhận dạng chính xác 
mẫu/giống quýt Hôi nhờ sự biến đổi nucleotide này. 
Mẫu/giống quýt ngọt Hà Giang (Q12) có sự thay 
thế nucleotide duy nhất ở vị trí 419, từ C thành T so 
với gen tham chiếu đã công bố trên NCBI và các 
mẫu/giống còn lại. Do đó mẫu/giống quýt ngọt Hà 
Giang có thể được nhận dạng chính xác nhờ sự sai 
khác này. 
Tương tự, mẫu/giống quýt Bộp (Q13) có sự thay 
thế nucleotide duy nhất ở vị trí 530, từ C thành G, 
khác so với các mẫu/giống còn lại và gen tham chiếu 
đã công bố trên NCBI. Vì vậy nhờ sự sai khác này 
nên mẫu/giống quýt Bộp có thể được nhận dạng 
chính xác trong tập đoàn nghiên cứu. 
4. KẾT LUẬN 
Độ tương đồng về trình tự nucleotide của 14 
mẫu/giống quýt nghiên cứu và trình tự tham chiếu 
đã công bố trên NCBI dao động từ 94,00% đến 99,59% 
với độ bao phủ dao động từ 96-97%. Các mẫu/giống 
quýt hồng (Tiểu Sơn), quýt Tràng Định, quýt Chum 
và quýt Bắc Kạn có mức độ tương đồng về trình tự so 
với gen tham chiếu cao nhất là 99,59%. Hệ số tương 
đồng di truyền của 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu 
dao động từ 93,59 - 99,73%, 14 mẫu/giống quýt 
nghiên cứu được phân thành 4 nhóm. Dựa vào trình 
tự vùng ITS của 14 mẫu/giống quýt nghiên cứu có 
thể nhận dạng được sáu mẫu/giống quýt đó là: quýt 
Tích Giang (Q4), quýt Hương Cần (Q5), quýt đỏ 
Ngọc Hội (Q9), quýt Hôi (Q11), quýt ngọt Hà Giang 
(Q12) và quýt Bộp (Q13), do có sự thay thế 
nucleotide ở một số vị trí, khác biệt so với các 
mẫu/giống khác và gen tham chiếu MH721728.1 
Citrus reticulata. Kết quả này rất có ý nghĩa, phục vụ 
cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu 
quả nguồn gen quýt bản địa của Việt Nam. 
LỜI CẢM ƠN 
 Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ 
kinh phí của đề tài “Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn 
gen và mã vạch ADN (DNA barcode) cho các loài 
cây có múi (bưởi, cam và quýt) bản địa/địa phương 
của Việt Nam” thuộc Chương trình trọng điểm phát 
triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực 
nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020, 
Bộ Nông nghiệp và PTNT. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Doyle, J. J. and Doyle J. L. (1990). Isolation of 
plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12:13-15. 
 2. Milena D. A., Marcia F. B. P., Frederique 
O.t, Ronan R., Edson M. A. S., Abelmon S. 
G., François L., Dominique G., Patrick 
O., and Fabienne M. (2019). Phylogenetic Origin of 
Primary and Secondary Metabolic Pathway Genes 
Revealed by C. maxima and C. reticulata Diagnostic 
SNPs. Front Plant Sci, 10: 1128. 
3. Oueslati A., Salhi-Hannachi A., Luro F., Vignes 
H., Mournet P., Ollitrault P. (2017). Genotyping by 
sequencing reveals the interspecific C. Maxima/C. 
Reticulata admixture along the genomes of modern 
citrus varieties of Mandarins, Tangors, Tangelos, 
Orangelos and Grapefruits. Plos One, 12 (10): 1371. 
4. Vilgalys R., Hopple J. S., and Hibbett D. 
S. (1994). Phylogenetic implications of generic 
concepts in fungal taxonomy: the impact of 
molecular systematic studies. Mycol. Helv. 6:73-91. 
5. Wu G. A., Prochnik S., Jenkins J., Salse J., 
Hellsten U., Murat F., et al. (2014). Sequencing of 
diverse mandarin, pummelo and orange genomes 
reveals complex history of admixture during citrus 
domestication. Nat.Biotechnol. 32: 656-662. 
6. Wu G. A., Terol J., Ibanez V., López-García A., 
Pérez-Román E., Borredá C., et al. (2018). Genomics 
of the origin and evolution of citrus. Nature, 554: 311-
316. 
7.https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PRO
GRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_
SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn 
8. www.megasoftware.net 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 9 
STUDYING ON DIVERSITY AND IDENTIFICATION OF VIETNAMESE NATIVE Citrus 
reticulata SPECIES BASED ON RIBOSOMAL DNA INTENAL TRANSCRIBED SPACER 
SEQUENCE 
Nguyen Thuy Diep1, Le Thi Thu Trang2, Kieu Thi Dung1, 
Dang Thi Thanh Ha1, Tran Dang Khanh1, 
 La Tuan Nghia2, Khuat Huu Trung1 
1Agricultural Genetics Institue 
 2Plant Resources Center 
Summary 
The Vietnamese native of mandarin orange genetic sources (C. reticulata) is very diversity and plentiful, 
which should be exploited and used, service for effectively and sustainably socio-economic development. 
Fourteen mandarin orange landraces have been collected in 10 different provinces and sequenced by 
amplification of the ITS locus in the nuclear genome. The ITS sequences of 14 mandarin orange accessions 
have been compared with reference gene which published in NCBI. The results showed that: similarity of 
the nucleotide sequence of landraces and the published reference gene on NCBI ranged from 94.00% to 
99.59% with coverage ranged from 96.00% to 97.00%. Genetic similarity coefficients of 14 mandarin orange 
accessions were in range from 93.59 to 99.73%, 14 mandarin orange accessions were divided into 4 main 
groups. Based on nucleotide differences in several positions in the ITS region sequence, six landraces have 
been identified correctly, include: Tich Giang (Q4), Huong Can (Q5) and Do Ngoc Hoi (Q9), Quyt Hoi 
(Q11), Ha Giang sweet tangerine (Q12) and Quyt Bop (Q13). This result is very useful for the conservation, 
exploitation and effective use of this precious genetic resources in Vietnam. 
Keywords: Nucleotide sequences, mandarin orange accessions, ITS, genetic diversity, PCR. 
Người phản biện: GS.TS. Ngô Xuân Bình 
Ngày nhận bài: 16/10/2020 
Ngày thông qua phản biện: 16/11/2020 
Ngày duyệt đăng: 23/11/2020