Evaluation of bacteriocin-Producing lactic acid bacteria strains isolated from “nem chua Thu Duc”

g sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên
nem chua Thủ Đức
Võ Ngọc Chi, Nguyễn Thị Phượng∗, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Đinh Anh Khoa,
Phan Bích Tuyền, Hoàng Diễm Hằng, Lê Thị Thủy & Kha Chấn Tuyền
Khoa Công Nghệ Hóa Học và Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh
THÔNG TIN BÀI BÁO
Bài báo khoa học
Ngày nhận: 27/01/2021
Ngày chỉnh sửa: 10/04/2021
Ngày chấp nhận: 16/04/2021
Từ khóa
Bacteriocin
Nem chua Thủ Đức
Pediococcus pentosaceus
Vi khuẩn lactic
Weissella paramesenteroides
∗Tác giả liên hệ
Nguyễn Thị Phượng
Email: nguyenthiphuong@hcmuaf.edu.vn
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu là tuyển chọn được các chủng vi
khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin được phân lập trên
nem chua tại Thủ Đức. Kết quả cho thấy có 2 trong số 8 chủng
vi khuẩn lactic được phân lập, có khả năng sinh bacteriocin là
Pediococcus pentosaceus trên nem chua Bà Chín lên men ngày
thứ 3 và Weissella paramesenteroides trên nem chua Diễm lên
men ngày thứ 5. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Pediococcus
pentosaceus và chủng Weissella paramesenteroides được phát
hiện bằng phương pháp khuếch tán thạch đều cho thấy hoạt
tính đối kháng với cả 4 chủng vi sinh vật chỉ thị là Escherichia
coli ATCC 25922, Salmonella enterica serova Typhimurium
ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 6538 và Bacillus
cereus ATCC 25924. Bacteriocin của chủng Pediococcus pen-
tosaceus có khả năng kháng khuẩn tốt với đường kính vòng vô
khuẩn tạo ra trung bình từ 12,20 - 16,07 mm. Đối với bacteri-
ocin của chủng Weissella paramesenteroides chỉ cho thấy hoạt
tính ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật chỉ thị với
đường kính vòng ức chế trung bình từ 9,75 - 15,27 mm. Tóm
lại có thể ứng dụng 2 chủng vi khuẩn lactic này trong việc tạo
ra các chế phẩm bacteriocin sinh học thay thế các chất bảo
quản hóa học kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm thực phẩm.
1. Đặt Vấn Đề
Nem chua là một sản phẩm thịt lên men truyền
thống rất được ưa chuộng tại Việt Nam, đây là
một ứng dụng điển hình của lên men acid lac-
tic trong thực phẩm. Vi khuẩn lactic là tác nhân
quan trọng để lên men thịt, chúng có thể ức chế
sự phát triển của vi sinh vật khác bao gồm vi
khuẩn gây độc và hư hỏng thực phẩm vì chúng
sản sinh ra nhiều loại chất kháng khuẩn chẳng
hạn như các acid hữu cơ, hydro peroxide, diacetyl
và bacteriocin (Pilasombut & ctv., 2015). Bacte-
riocin của vi khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều
nhất do tính ưu việt của chúng trong bảo quản
thực phẩm cũng như tính an toàn với người sử
dụng (Woraprayote & ctv., 2016). Bacteriocins
thường không làm gây ra những thay đổi trong
sản phẩm thực phẩm và có thể được sử dụng
như một phụ gia bổ sung trong chế biến thực
phẩm, giảm cường độ của các phương pháp xử lý
truyền thống, chẳng hạn như gia nhiệt. Hiện nay,
xu hướng về tiêu dùng các loại sản phẩm thực
phẩm với hương vị tươi ngon và không sử dụng
hóa chất bảo quản ngày càng tăng cao. Vì vậy,
các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên và có
hoạt tính kháng khuẩn sinh học như LAB bacte-
riocin được tìm kiếm để ứng dụng vào ngành công
nghiệp thực phẩm thay thế các chất bảo quản hóa
học bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng thực phẩm.
2. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu
2.1. Vật liệu
Nem Bà Chín được thu thập từ cơ sở nem Bà
Chín ở địa chỉ: số 58 đường Trần Hưng Đạo,
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
64 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Phường Hiệp Phú, Quận 9, Thành phố Hồ Chí
Minh và Nem Diễm được thu thập từ cơ sở nem
Diễm ở địa chỉ: số 41 đường Lê Văn Ninh, Phường
Linh Tây, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí
Minh.
Chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm: Escherichia
coli ATCC 25922, Salmonella enterica serova Ty-
phimurium ATCC 13076, Staphylococcus aureus
ATCC 6538, Bacillus cereus ATCC 25924. Bốn
chủng vi sinh vật chỉ thị được cung cấp bởi Viện
Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Công
Nghiệp TP.HCM.
Môi trường: MRS broth, MRS agar, TSB, TSA
(Himedia, Ấn Độ).
Hóa chất: NaCl 0,85%, glycerol, H2O2 3%, cồn
95%, CaCO3, NaOH, Crystal Violet, Safranin,
Lugol.
Thuốc thử: Đĩa giấy thử phản ứng oxydase.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn: 225 mL dung dịch NaCl
0,85% vô trùng được cho vào bao PE vô trùng
có chứa 25 g nem chua. Sau đó, đặt túi mẫu vào
trong máy dập mẫu và đồng nhất trong vòng 1
phút để tạo thành dung dịch huyền phù mẹ có
nồng độ 10−1. Dịch huyền phù được xác định
pH, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ
10−8 (Mathara & ctv., 2004). Tiến hành cấy đĩa
ở các nồng độ 10−5, 10−6, 10−7 và 10−8. Dùng
micropipette hút 100 µL dung dịch pha loãng cho
lên bề mặt đĩa thạch MRS. Dùng que cấy trang
đã tiệt trùng dàn đều dịch cho đến khi bề mặt
thạch khô. Đĩa thạch được đem đi ủ kỵ khí trong
48 giờ ở 37oC.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic bằng
cách tiến hành xác định hình thái khuẩn lạc,
nhuộm Gram, xác định đặc điểm tế bào, đồng
thời khảo sát khả năng di động và kiểm tra các
phản ứng sinh hóa như catalase, oxydase, khả
năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn đã
phân lập được.
Gia tăng sinh khối và thu dịch ly tâm sinh khối:
Dùng que cấy tiệt trùng lấy 1 vòng que cấy vi
khuẩn trong ống gốc eppendorf cho vào ống ly
tâm vô trùng có chứa 10 mL MRS. Các ống ly
tâm này được ủ ở 37oC trong 16 - 18 giờ (Hoa &
ctv., 2012). Các ống ly tâm sẽ được đem ly tâm
ở 8000 vòng trong 15 phút ở 4oC thu dịch nổi.
Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm
bởi sự ức chế gây ra bởi các acid hữu cơ có mặt
trong môi trường, sau khi ly tâm xong dịch nổi
được điều chỉnh pH bằng NaOH 1 N để đạt pH 6,8
- 7,0 (Nguyen & ctv., 2017). Sau đó lấy phần dịch
nổi bơm qua màng lọc Minisart (d = 0,2 µM) để
tách cặn khuẩn còn sót lại. Phần dịch lỏng thu
được sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin bằng
phương pháp khuếch tán đĩa giấy theo Kirby
Bauer. Tiến hành tăng sinh 4 chủng vi sinh vật
chỉ thị bao gồm Escherichia coli, Salmonella Ty-
phimurium, Bacillus cereus và Staphylococcus au-
reus trong ống nghiệm chứa 10 mL môi trường
TSB nuôi ở 30oC trong 8 - 10 giờ. Sau đó 100 µL
mỗi dung dịch được trải trên đĩa thạch TSA. Đặt
đĩa giấy đã được vô trùng có kích thước d = 7 mm
(4 - 6 đĩa giấy) trên đĩa môi trường thạch, dùng
micropipette hút 20 µL dịch ly tâm của LAB ở
trên cho vào từng đĩa giấy. Các đĩa được giữ trong
tủ lạnh ở 4oC trong 4 giờ và sau đó ủ ở 30oC trong
24 giờ.
Định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng
sinh bacteriocin với phương pháp thực hiện như
sau: Tách chiết DNA và thực hiện PCR với mồi
đặc hiệu vùng 16s. Sau đó giải trình tự trực tiếp
rồi so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu NCBI
bằng công cụ BLAST SEARCH từ đó xác định
mẫu vi khuẩn thuộc loài nào.
2.3. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft
Excel 2013 và Statgraphics với độ tin cậy là 95%.
3. Kết Quả và Thảo Luận
3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ
các dòng vi khuẩn lactic phân lập được
Nguyen & ctv., (2013) đã phân lập được các
chủng LAB từ nem chua bao gồm: Lactobacil-
lus pentosus, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. para-
casei, Lb. fermentum, Lb. acidipiscis, Lb. farci-
minis, Lb. rossiae, Lb. fuchuensis, Lb. namuren-
sis, Lc. lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc
fallax, Pediococcus acidipiscis, Pediococcus pen-
tosaceus, Pediococcus stilesii,Weissella cibaria và
Weissella paramesenteroides. LAB là tác nhân
quan trọng để lên men thịt, chúng có thể ức chế
sự phát triển của vi sinh vật khác bao gồm vi
khuẩn gây độc và hư hỏng thực phẩm vì chúng
sản sinh ra nhiều loại chất kháng khuẩn chẳng
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 65
S. aureus B. cereus S. Typhimurium E. coli
Hình 1. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB1.
S. aureus B. cereus E. coli S. Typhimurium
Hình 2. Hoạt tính ức chế của chủng vi khuẩn lactic LAB2 trên môi trường TSA.
Bảng 1. Đường kính vòng kháng khuẩn của LAB1 trên môi trường TSA
Vi
khuẩn
Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB1 (dkk) mm
Staphylococcus aureus Bacillus cereus Salmonella Typhimurium Escherichia coli
Đường
kính
13,53a ± 0,21 16,07b ± 0,21 12,80ac ± 0,20 12,20c ± 0,70
a,b,cCác ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
Bảng 2. Đường kính vòng ức chế LAB2 trên môi trường TSA
Vi
khuẩn
Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn LAB2 (dkk) mm
Staphylococcus aureus Bacillus cereus Salmonella Typhimurium Escherichia coli
Đường
kính
11,90a ± 0,36 15,27b ± 0,35 9,75c ± 0,36 11,78a ± 0,27
a,b,cCác ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
hạn như các acid hữu cơ, hydro peroxide, diacetyl
và bacteriocin (Pilasombut & ctv., 2015).
Kết quả nghiên cứu trên 8 chủng vi khuẩn lac-
tic phân lập được từ 2 loại nem chua Thủ Đức đối
với 4 chủng vi sinh vật chỉ thị cho thấy có 2 chủng
vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin là
chủng LAB1 (được phân lập từ nem Bà Chín) và
LAB2 (được phân lập từ nem Diễm) (Hình 1 và
2). Chủng vi khuẩn LAB1 được phân lập từ nem
Bà Chín kháng cả 4 chủng vi sinh vật gây bệnh
chỉ thị và có đường kính vòng kháng khuẩn trung
bình từ 12,20 - 16,07 mm (Bảng 1). Trong khi
đó, chủng vi khuẩn LAB2 được phân lập từ nem
Diễm có hoạt tính ức chế đối với 4 chủng vi sinh
vật chỉ thị với đường kính vùng ức chế trung bình
từ 9,75 - 15,27 mm (Bảng 2). Trong nghiên cứu
này cả 2 chủng vi khuẩn LAB1và LAB2 đều cho
thấy hoạt tính đối kháng với cả vi khuẩn Gram
âm và vi khuẩn Gram dương. Nhìn chung đường
kính vòng tròn kháng khuẩn hay ức chế của bac-
teriocin được sản sinh bởi vi khuẩn lactic đối với
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
66 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Hình 3. Dạng khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của mẫu LAB1.
Hình 4. Trình tự gen chi tiết của mẫu LAB1.
Hình 5. Dạng khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của mẫu LAB2.
vi khuẩn Gram dương là lớn hơn so với vi khuẩn
Gram âm. Vì vi khuẩn Gram dương chỉ có một
lớp lipid, chúng thường nhạy cảm hơn so với vi
khuẩn Gram âm. Sự khác biệt này là vì vi khuẩn
Gram âm có màng ngoài và không gian chu chất
trong khi ở vi khuẩn Gram dương thì không tìm
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 67
Hình 6. Trình tự gen chi tiết của mẫu LAB2.
thấy (Ceylan & Fung, 2007).
3.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn lac-
tic sinh bacteriocin
Kết quả giải trình tự gen cho thấy mẫu LAB1
thuộc loài Pediococcus pentosaceus với mức tương
đồng 100% (Hình 4). Với đặc điểm khuẩn lạc là
khuẩn lạc tròn, bóng, vun cao, màu trắng sữa, rìa
nguyên, đường kính khoảng 2 - 3 mm (Hình 3).
Và đặc điểm tế bào như sau: Tế bào có dạng hình
cầu đôi, cầu tứ, tế bào vi khuẩn Gram dương.
Theo Bajpai & ctv. (2016), dịch ly tâm sinh khối
của Pediococcus pentosaceus thể hiện tác dụng
kháng khuẩn đáng kể (P < 0,05) với đường kính
của vùng ức chế (16,5 - 20,4 mm) chống lại các
vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.
Kết quả giải trình tự gen cho thấy mẫu LAB2
thuộc loài Weissella paramesenteroides với mức
tương đồng 100% (Hình 6). Với đặc điểm khuẩn
lạc là khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, rìa nguyên,
vun nhẹ, đường kính từ 1 - 2 mm (Hình 5). Và đặc
điểm tế bào như sau: Tế bào có dạng cầu trực, kết
chuỗi, tế bào vi khuẩn Gram dương. Papagianni
& Papamichael (2011) đã chỉ ra rằng Weissella
paramesenteroides tạo ra một bacteriocin có tên
là weissellin A, có khả năng chịu nhiệt lên đến
121oC trong 1 giờ, và duy trì hoạt động của nó
trong phạm vi pH từ 2 - 10 hoạt động chống lại
đa số các vi khuẩn Gram dương. Các đặc tính của
weissellin A làm cho nó trở thành một tác nhân
đầy hứa hẹn trong việc bảo quản thực phẩm.
4. Kết Luận
Trong nghiên cứu này, 8 chủng vi khuẩn lac-
tic trên hai loại nem chua tại Thủ Đức là nem
Bà Chín và nem Diễm đã được phân lập. Từ
kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của 8
chủng vi khuẩn lactic này trên 4 chủng vi sinh
vật chỉ thị bao gồm Escherichia coli, Salmonella
Typhimurium, Bacillus cereus và Staphylococcus
aureus cho thấy có 2 chủng LAB có khả năng
sinh bacteriocin đó là Pediococcus pentosaceus và
Weissella paramesenteroides. Với khả năng sinh
bacteriocin, 2 chủng này có thể đem lại nhiều
tiềm năng mang tính ứng dụng trong việc tạo ra
chất bảo quản thực phẩm tự nhiên.
Lời Cảm Ơn
Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM đã tài trợ cho chúng tôi thực hiện
đề tài này (Mã số đề tài: CS-SV19-CNTP-04).
Tài Liệu Tham Khảo (References)
Bajpai, V. K., Han, J. H., Rather, I. A., Majumder, R.,
Nam, G. J., ChanSeo, P., Lim, J., Paek, W. K., & Park,
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
68 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Y. H. (2016). Characterization of lactic acid bacterium
Pediococcus pentosaceus 4I1 from freshwater fish Zacco
koreanus and its antibacterial mode of action. PeerJ
PrePrints 4, e2121v1.
Ceylan, D. C., & Fung, Y. C., 2007. Antimicrobial activ-
ity of spices 1. Journal of Rapid Methods and Automa-
tion in Microbiology 12(1), 1-55.
Hoa, T. T. M., & Nguyen, A. L. (2012). Classify of bacte-
ria lactococcus PD14 synthesized bacteriocin. Vietnam
Journal of Science and Technology 50(5), 635.
Mathara, J. M., Schillinger, U., Kutima, P. M., Mbugua,
S. K., & Holzapfel, W. H. (2004). Isolation, identifica-
tion and characterisation of the dominant microorgan-
isms of kule naoto: the Maasai traditional fermented
milk in Kenya. International Journal of Food Micro-
biology 94(3), 269-278.
Nguyen, D. T. L., Hoang, V. T., Nguyen, T. T. T.,
& Nguyen, A. H. (2016). Isolation and selection
of lactic acid bacteria from Vietnamese fermented
pork meat product with antimicrobial activity and
characterization of bacteriocin. Vietnam Journal of
Agricultural Science 14(7), 1089-1099.
Nguyen, D. T. L., Van Hoorde, K., Cnockaert, M., De
Brandt, E., Aerts, M., & Vandamme, P. (2013). A
description of the lactic acid bacteria microbiota as-
sociated with the production of traditional fermented
vegetables in Vietnam. International Journal of Food
Microbiology 163(1), 19-27.
Papagianni, M., & Papamichael, E. M. (2011). Purifica-
tion, amino acid sequence and characterization of the
class IIa bacteriocin weissellin A, produced by Weis-
sella paramesenteroides DX. Bioresource Technology
102(12), 6730-6734.
Pilasombut, K., Rumjuankiat, K., Ngamyeesoon, N., &
Le, D. N. D. (2015). In vitro characterization of bac-
teriocin produced by lactic acid bacteria isolated from
Nem Chua, a traditional Vietnamese Fermented Pork.
Korean Journal for Food Science of Animal Resources
35(4), 473-478.
Woraprayote, W., Malila, Y., Sorapukdee, S., Swetwi-
wathana, A., Benjakul, S., & Visessanguan, W. (2016).
Bacteriocins from lactic acid bacteria and their appli-
cations in meat and meat products. Meat Science 120,
118-132.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2) www.jad.hcmuaf.edu.vn