Đánh giá tính đồng nhất của mẫu giống bạch chỉ (Argelica dahurica) bằng chỉ thị phân tử ISSR

esis Ha et Grushv.). Mei et al. (2015) đã đánh 
gia đa dạng di truyền của các giống Đương quy 
(Angelica sinensis) và một số loài khác trong chi 
Angelica thu thập từ các vùng khác nhau ở Trung 
Quốc bằng chỉ thị ISSR và RAPD. 
Yousefiazarkhanian et al. (2016) đã đánh giá đa dạng 
di truyền các loài trong chi Salvia bằng chỉ thị ISSR 
và RAPD. Huan et al. (2009) đã xác định ổn định di 
truyền của cây Platanus acerifolia nuôi cấy mô duy trì 
8 năm bằng chỉ thị ISSR. Hệ số di truyền của 20 cây 
sau 8 năm duy trì trong điều kiện in vitro là 91%. Guo 
et al. (2009) đã đánh giá đa dạng di truyền 20 nguồn 
gen của 4 giống bạch chỉ bằng chỉ thị ISSR. Tổng 
cộng 97 băng ISSR tạo ra từ khuếch đại 9 mồi, trong 
đó có 37 băng đa hình. 20 quần thể của nguồn gen đã 
được chia làm 2 nhóm lớn. Hệ số đồng dạng di 
truyền từ 0,752 đến 0,835. Kết quả nghiên cứu trên 
đã cho cho thấy có thể sử dụng chỉ thị phân tử DNA 
để đánh giá tính đồng nhất của quần thể giống cây 
trồng, góp phần định hướng chọn giống nhanh hơn 
và chính xác hơn. Trong bài báo này, thông báo kết 
quả đánh giá tính đồng nhất di truyền mẫu giống 
bạch chỉ BC9 ở thế hệ F4 bằng chỉ thị phân tử ISSR. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 18 
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu 
Lá non của 20 cây bạch chỉ ở thế hệ F4 được thu 
thập ngẫu nhiên từ ruộng thí nghiệm khảo nghiệm 
DUS tại Mộc Châu, tỉnh Sơn La năm 2019. Mẫu lá 
được bảo quản trong túi ni lông, sau đó được rửa 
sạch, thấm khô, tách chiết DNA tổng số. 
2.2. Phương pháp 
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 
Mẫu lá non được nghiền trong ni tơ lỏng đến bột 
mịn. Sau đó chuyển 100 mg vào ống 2 ml để tách 
chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doyle & 
Doyle (1987) có cải tiến. DNA tổng số sau khi thu 
được, xử lý bằng nhúng vào dung dịch Ammonium 
acetat (3M) trong thời gian 30 giây, rửa bằng cồn 70o 
và hòa tan trong nước cất vô trùng. DNA tổng số 
được loại bỏ RNA bằng cách ủ với RNAse I ở 37oC 
trong 3 giờ. Độ tinh sạch của DNA được kiểm tra 
bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Nồng độ DNA 
tổng số được đo bằng máy quang phổ trước khi tiến 
hành PCR. 
2.2.2. Phản ứng ISSR-PCR 
Mồi ISSR (Inter simple sequence repeat) và chu 
trình phản ứng PCR được sử dụng trong nghiên cứu 
theo Guo et al. (2009). Mồi ISSR được cung cấp bởi 
hãng IDT (Hoa Kỳ). Phản ứng PCR được thực hiện 
trong thể tích 25 µl. Mỗi phản ứng gồm 30 ng DNA, 
mồi (1 µM), 100 mM mỗi loại dNTP, đệm PCR và 1 U 
enzym Taq polymerse. Phản ứng PCR được tiến 
hành trên máy PCR với chu trình nhiệt: 94oC - 5 phút; 
94oC – 30 giây; 48-56oC phụ thuộc vào mồi (Bảng 1) – 
45 giây; 72oC- 2 phút; lặp lại 39 lần từ bước 2 đến 
bước 4; 72oC - 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di 
trong gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 70 V, trong 60 
phút sử dụng dung dịch đệm TAE, chứa Ethidium 
Bromid. Sản phẩm PCR được chụp ảnh và phân tích 
gel bằng Gel DocIt2 của Hãng UVP (Hoa Kỳ). 
Bảng 1. Tên mồi ISSR, trình tự mồi và nhiệt độ gắn 
mồi trong phản ứng PCR 
TT Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt 
độ gắn 
mồi 
(oC) 
1 UBC815 CTC T CT CTC TCT CTC TG 50 
2 UBC834 AG A GAG A GA GAG A GA GYT 56 
3 UBC841 GAG AGA GA G AGA G AG AYC 54 
4 UBC853 TCT CT C TCT CTC TCT CRT 50 
5 UBC857 ACA CAC ACA CA C A CA CYG 54 
6 UBC862 AG C AG C AG C A GC A GC A GC 56 
7 UBC864 ATG ATG ATG A TG ATG A TG 48 
8 UBC868 GA A GAA G AA GA A GA A GAA 48 
9 UBC900 ACT TCC CA A CAG GTT AA C A CA 56 
Ghi chú: Y: là base C hoặc T; R là base A hoặc G. 
2.2.3. Ghi nhận dữ liệu và phân tích thống kê 
Các băng DNA có mặt ghi nhận (1), vắng mặt 
ghi nhận (0) đối với mỗi mồi trên cơ sở kích thước 
băng. Ma trận 1/0 được sử dụng để ước tính mức độ 
khác nhau về di truyền hoặc tương đồng về di truyền 
giữa các cây. Hàm lượng thông tin đa hình được tính 
theo phương pháp của Weir (1996). Xác định hệ số 
tương đồng di truyền Jaccard, xây dựng sơ đồ hình 
cây quan hệ di truyền của 20 cây bạch chỉ dựa theo 
phương pháp UPGMA trong NTsys-pc (Rohlf, 1998). 
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Tách chiết DNA tổng số 
Hình 1. Ảnh điện di DNA tổng số. Giếng 1-20 tương ứng các mẫu cây BC1 đến BC20 
DNA tổng số tách chiết từ lá tươi của các dòng 
cây được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% 
(Hình 1). Nồng độ DNA được xác định bằng phương 
pháp đo quang phổ hấp phụ. Nồng độ DNA tổng số ở 
các mẫu dao động từ 632-899 ng/µl (Bảng 2). Hình 
ảnh điện di DNA tổng số trên hình 1 và chỉ số 
A260/A280 ở các mẫu dao động từ 1,85-1,99 trong 
bảng 2 cho thấy các mẫu DNA tổng số đã được loại 
bỏ hoàn toàn RNA, có thể được sử dụng cho phản 
ứng PCR. 
Bảng 2. Nồng độ DNA tổng số của các cây BC1 đến 
BC20 
TT Tên mẫu 
cây 
Chỉ số 
A260/280 
Nồng độ DNA 
(ng/µl) 
1 BC1 1,89 740 
2 BC2 1,86 670 
3 BC3 1,85 860 
4 BC4 1,97 840 
5 BC5 1,89 830 
6 BC6 1,87 632 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 19 
7 BC7 1,93 848 
8 BC8 1,89 775 
9 BC9 1,88 742 
10 BC10 1,95 866 
11 BC11 1,86 848 
12 BC12 1,98 772 
13 BC13 1,97 899 
14 BC14 1,93 840 
15 BC15 1,95 648 
16 BC16 1,85 847 
17 BC17 1,96 759 
18 BC18 1,89 748 
19 BC19 1,99 798 
20 BC20 1,90 728 
Ghi chú: Nơi thu mẫu: huyện Mộc Châu, tỉnh 
Sơn La 
3.2. Đáng giá đồng nhất di truyền các cây bạch 
chỉ bằng chỉ thị ISSR 
Tổng cộng 44 băng DNA tạo ra đã được ghi 
nhận từ sản phẩm khuếch đại PCR của 20 mẫu cây 
bạch chỉ (BC1 đến BC20) sử dụng 9 mồi, trong đó 
băng lớn nhất có kích thước khoảng 2,0 kb và băng 
có kích thước nhỏ nhất khoảng 0,1 kb (Bảng 3). 
Trung bình thu được 4,89 băng/mồi. Số băng đồng 
hình thu được là 1,67 băng/mồi, chiếm 34,09%, số 
băng đa hình trung bình thu được 3,22 băng/mồi, 
chiếm 65,91%. Mức độ đa hình của các băng DNA 
thu được phản ánh sự khác nhau trong cấu trúc DNA 
của hệ gen các cây. Chỉ số PIC thu được trung bình 
là 0,339. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 20 mẫu cây 
được thể hiện trong hình 2. Mẫu BC6 có sự khác biệt 
nhất so với các mẫu khác khi khuếch đại mồi U815, 
U834, U841, U853, U868. 
Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm ISSR-PCR với các mồi khác nhau. M: thang chuẩn DNA (100 bp). Giếng 1-20: 
tương ứng mẫu cây BC1 đến BC20 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 20 
Bảng 3. Kết quả khuếch đại PCR 20 mẫu cây bạch chỉ (BC1 đến BC20) bằng 9 mồi ISSR 
TT Tên mồi Số băng 
thu được 
Số băng 
đồng hình 
Tỷ lệ băng 
đồng hình 
(%) 
Số băng 
đa hình 
Tỷ lệ băng 
đa hình 
(%) 
Chỉ số 
PIC 
Kích thước 
băng (kb) 
1 UBC815 9 1 11,11 8 88,89 0,336 0,25-1,0 
2 UBC834 6 3 50,00 3 50,00 0,281 0,20-1,1 
3 UBC841 5 0 0 5 100 0,638 0,3-0,55 
4 UBC853 6 1 16,67 5 83,33 0,660 0,3-0,7 
5 UBC857 3 3 100 0 0 0,000 0,2-0,40 
6 UBC862 3 3 100 0 0 0,000 0,1-0,35 
7 UBC864 2 2 100 0 0 0,000 0,4- 0,5 
8 UBC868 3 0 0 3 100 0,698 0,4-0,7 
9 UBC900 7 2 28,57 5 71,43 0,438 0,2-2,0 
Tổng số băng 44 15 29 0,1 -2,0 kb 
Trung bình 4,89 1,67 34,09 3,22 65,91 0,339 
Bảng 4. Hệ số tương đồng của 20 cây bạch chỉ (BC1 đến BC20) 
Hình 3. Sơ đồ cây quan hệ di truyền giữa 20 cây bạch chỉ BC1 đến BC20 
Số liệu thu được sau khi thực hiện phản ứng 
PCR được thống kê và phân tích qua phần mềm 
NTSYS2.1 thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền 
giữa các cây (Bảng 4). Trên cơ sở hệ số tương đồng 
di truyền của 20 cây, mối quan hệ giữa chúng đã 
được thiết lập, thể hiện qua sơ đồ cây quan hệ di 
truyền (Hình 3). Hệ số tương đồng di truyền trung 
bình của 20 cây dao động từ 0,52 đến 1,0, trung bình 
là 0,66. Quan hệ di truyền của 20 cây được chia làm 2 
nhóm lớn: Nhóm thứ nhất gồm cây BC6; Nhóm thứ 2 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 21 
gồm 19 cây còn lại BC1, BC2, BC3, BC4, BC5, BC7, 
BC8, BC9, BC10, BC11, BC12, BC13, BC14, BC15, 
BC16, BC17, BC18, BC19, BC20. Khi loại bỏ cây 
BC6, hệ số tương đồng di truyền của 19 cây còn lại 
dao động từ 0,80 đến 1,0. Theo George (20004), khi 
đánh giá tính đồng nhất di truyền của các cây ngô 
(Zea mays), loài cây sinh sản giao phấn chéo bằng 
phân tích chỉ thị SSR, tác giả đã loại bỏ những mẫu 
có hệ số sai khác di truyền dưới 0,20 hay hệ số tương 
đồng di truyền dưới 0,80. Điều này có nghĩa là những 
cây có hệ số tương đồng di truyền ≥ 0,80 có thể được 
coi là đồng nhất di truyền đối với các giống giao phấn 
chéo. Bạch chỉ cũng là giống cây trồng sinh sản theo 
hình thức giao phấn chéo. Như vậy, trong nghiên cứu 
này, trong tổng số 20 cây bạch chỉ từ thí nghiệm 
khảo nghiệm DUS, nếu loại bỏ cây BC6 thì 19 cây 
bạch chỉ còn lại có thể thu được hạt giống thuần. 
Như vậy, sử dụng chỉ thị phân tử ISSR đã xác nhận 
được 1 cây khác dạng trong số 20 cây nghiên cứu. 
Theo quy phạm khảo nghiệm DUS một số cây 
trồng, áp dụng quần thể chuẩn với tỷ lệ cây khác 
dạng tối đa là 1% với xác suất chấp nhận tối thiểu là 
95%. Đối với các giống mướp đắng (Momordica 
charantia L) lai thì căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng 
trên tổng số cây trên ô thí nghiệm, trong trường hợp 
độ lớn của mẫu là 40 cây, số cây khác dạng cho phép 
là 2 cây (QCVN 01-153: 2014/BNNPTNT). Rau dền 
thuộc chi Amaranthus L. số cây quan sát là 60 (cả 2 
lần nhắc lại), số cây khác dạng tối đa cho phép là 2 
(QCVN 01-156: 2014/BNNPTNT). Bông (Gossypium 
L.) nếu tổng số cây được đánh giá là 200 thì số cây 
khác dạng tối đa cho phép là 4 cây (CVN 01-
123:2013/BNNPTNT); Gừng (Zingiber officinale 
Rosc.), trong trường hợp độ lớn của mẫu là 30 cây, số 
cây khác dạng tối đa được chấp nhận là 1 
(International Union for the Protection of New 
Varieties of Plants, 1996). Đối với khoai tây (Solanum 
tuberosum (L.), số cây quan sát là 100 (trong 2 lần 
nhắc lại) thì số cây khác dạng tối đa cho phép là 3 
(QCVN 01-69: 2011/BNNPTNT). 
Mẫu giống bạch chỉ BC9 nhập nội sau 3 thế hệ 
chọn lọc từ năm 2012- 2018 theo sơ đồ chọn lọc giống 
cây giao phấn chéo của Vũ Đình Hòa và cộng sự 
(2005). Hạt giống thế thệ F3 thu được tiến hành khảo 
nghiệm VCU và DUS năm 2017-2018 cho thế hệ F4. 
Kết quả đánh giá đồng nhất di truyền của giống dựa 
vào các đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo 
nghiệm DUS (theo kiểu hình) cho thấy tỷ lệ cây khác 
dạng ở thế hệ F4 là 1 cây trong số 30 cây theo dõi, 
chứng tỏ mẫu giống đồng nhất về hình thái. Trong 
nghiên cứu này, kết quả đánh giá tính đồng nhất di 
truyền bằng chỉ thị ISSR tương ứng với kết quả đánh 
giá tính đồng nhất bằng kiểu hình ghi nhận qua các 
đặc điểm hình thái của bảng mô tả giống bạch chỉ và 
Quy phạm khảo nghiệm giống bạch chỉ cơ sở do 
Viện Dược liệu ban hành. 
4. KẾT LUẬN 
Tổng cộng 44 băng DNA có kích thước từ 0,1 kb 
-2,0 kb đã được tạo ra từ khuếch đại 20 mẫu cây bạch 
chỉ sử dụng 9 mồi ISSR. Trung bình thu được 
4,89/mồi. Số băng đồng hình 1,67 băng/mồi, chiếm 
34,09%, số băng đa hình 3,22 băng/mồi, chiếm 
65,91%. Hệ số tương đồng di truyền giữa 20 mẫu cây 
dao động từ 0,52-1,00. Chỉ số PIC trung bình thu 
được trung bình là 0,339. Cây BC6 là cây khác dạng 
so với 19 cây khác. 19 trong tổng số 20 cây còn lại có 
hệ số di truyền cao trên 0,80, chứng tỏ mẫu giống 
bạch chỉ sau ở thế hệ F4 có tính đồng nhất, có thể 
được sử dụng để sản xuất hạt giống. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004). Cây thuốc và 
động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập II, NXB Khoa 
học và Kỹ thuật. 
2. Vũ Đình Hòa, Vũ Văn Liết, Vũ Văn Hoan 
(2005). Giáo trình chọn giống cây trồng. Đại học 
Nông nghiệp Hà Nội. 
3. Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Hoàng 
Thanh Tùng, Vũ Thị Hiền, Trần Xuân Tình, Đỗ Khắc 
Thịnh, Dương Tấn Nhật (2015). Đáng giá sự ổn định 
di truyền cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamesis Ha 
et Grushv. bằng chỉ thị RAPD. Tạp chí Công nghệ 
Sinh học, 13(1):63-73. 
4. Doyle JJ and Doyle JL (1987). A rapid DNA 
isolation procedure for small quantities of fresh leaf 
tissue. Phytochemical Bulletin, 19:11-15. 
5. George MLC (2004). Protocols for Maize 
Genotyping using SSR Markers and Data Analysis -
Laboratory Handbook, Ambionet Service Laboratory, 
International Maize and Wheat Improvement Center 
(CIMMYT). 
6. Guo D-y, Ma Y-y, Tang L, Chen Y-z, Qiang L 
(2009). Genetic diversity of Radix Angelicae 
Dahuricae germplasmic resource based on ISSR 
analysis. Chinese Traditional and Herbal 

Drugs, 40(10):1627-1630. 
7. Huang WJ, Ning GG, Liu GF and Bao MZ 
(2009). Determination of genetic stability of long-
term micropropagated plantlets of Platanus acerifolia 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 22 
using ISSR markers. Biologia Plantarum 53 (1): 159-
163. 
8. International Union for the Protection of New 
Varieties of Plants (1996). Guidelines For the 
Conduct of Test for Distinctiveness, Uniformity and 
Stability On Ginger (Zingiber officinale Rosc.). 
9. Meia Z, hang C, Khana A, Zhu Y, Taniaa M, 
Luo P, Fu J (2015). Efficiency of improved RAPD and 
ISSR markers in assessing genetic diversity and 
relationships in Angelica sinensis (Oliv.) Diels 
varieties of China, Electronic Journal of 
Biotechnology, 18(2): 96-102. 
10. Nei M and Li WH (1979). Mathematical 
model for studying genetic variation in terms of 
restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. 
76:5269–5273. 
11. Rohlf FJ (1998). 
12. NTSyS-p.c. Numerical Taxonomy and 
Multivariate Analysis System (Version 2.0). Exeter 
Software Publishers Ltd., Setauket. 
13. Yousefiazarkhanian M, Asghari A, Ahmadi J, 
Asghari B, Jafari AA (2016). Genetic Diversity of 
Salvia Species Assessed by ISSR and RAPD Markers. 
Not Bot Horti Agrobo, 44(2):431-436. 
14. Weir BS (1996). Genetic Data Analysis II: 
Methods for Discrete Population Genetic Data. 
Sinauer Associates, Inc., Sunderland. 
EVALUATION OF GENETIC UNIFORMITY OF Argelica dahurica USING ISSR MARKER 
Nguyen Van Khiem1*, Tran Ngoc Thanh1, Nguyen Minh Tuyen1, Dinh Thanh Giang1, 
Duong Thi Ngoc Anh1, Duong Thi Phuc Hau1, Tran Danh Viet1, Tran Thi Kim Dung1 
1National Institute of Medicinal Mterials 
*Email: ngvankhiem@yahoo.com 
Summary 
In the present study, genetic uniformity of Argelica dahurica at F4 generation was evaluated using ISSR 
marker. Total of 20 plants collected randomly in DUS test experiment in Moc Chau – Son La province in 
2019. Nine primers were used in the PCR reactions producing 44 bands, sizing 0.1 – 2.0 kb. An average of 
4.89 bands/primer was obtained. The rate of polymorphic band was 3.22/primer (65.91%). The coefficient of 
genetic similarity between 20 plants ranged from 0.52 to 1.00. PIC coefficient was 0.339. BC6 was off-type 
plant. The coeffect of genetic similarity of remaining 19 plants (except BC6 plant) ranged from 0.80-1.0. 
Thus, 19 these plants could be used for seed production due to high genetic uniformity. 
Keywords: Genetic Uniformity, genetic Similarity, Argelica dahurica, ISSR. 
Người phản biện: PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng 
Ngày nhận bài: 6/7/2020 
Ngày thông qua phản biện: 6/8/2020 
Ngày duyệt đăng: 13/8/2020