Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây gừng núi đá bằng chỉ thị phân tử

 chương trình chạy 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 12 
PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4 µl loading dye 
rồi tiến hành điện di. 
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 
Cân 0,6 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun 
đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-50C 
bổ sung 2,5 l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel 
đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã 
nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel 
vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng 
điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm. 
Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 l 
loading dye và tra vào các giếng trên gel. 
Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy 
điện di được kết nối với bộ nguồn. Đặt 130 V. 
Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN 
sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr. 
2.3.5. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 
- Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, 
cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2 ml. 
- Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 
thể tích gel (100 mg ~100 μl). 
- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho 
đến khi gel tan hoàn toàn. 
- Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của 
dung dịch phải là màu vàng, nếu là màu cam hoặc 
màu tím xanh thì phải bổ sung 10 μl sodium acetate 
3M, pH 5. 
- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột 
QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. 
- Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và 
ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại 
hết agarose dư thừa. 
- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để 
cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13.000 
vòng/phút trong 1 phút. 
- Chuyển cột QIAquick sang ống 
microcentrifuge 1,5 ml sạch. 
- Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 
8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 
13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu lượng ADN tinh 
sạch. 
2.3.6. Giải trình tự 
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, được giải 
trình tự tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả 
giải trình tự được so sánh với các trình tự tương đồng 
trên NCBI. Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và 
phân tích bằng chương trình MEGA v6.06 để tạo cây 
phát sinh loài. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Kết quả PCR của 15 mẫu Gừng núi đá trong 
nghiên cứu 
ADN của 15 mẫu lá của cây Gừng núi đá được 
thu thập từ 15 xã của 5 huyện thuộc tỉnh Hà Giang 
sau khi tách chiết đều có nồng độ và độ tinh sạch 
cao, các băng gọn sắc nét, đảm bảo cho các bước thí 
nghiệm tiếp theo. 
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi trnL-
e/trnL-f. Kết quả thu được cho thấy các mẫu lá thuộc 
15 mẫu Gừng núi đá đều cho băng đơn hình với kích 
thước trong khoảng 730 bp (Hình 1). 
Hình 1. Kết quả PCR của 15 mẫu Gừng núi đá nghiên 
cứu với cặp mồi trnL-e/trnL-f; M: Marker generuler 
1kb plus DNA 
3.2. Kết quả giải trình tự của 15 mẫu Gừng núi 
đá nghiên cứu 
Sản phẩm PCR với cặp mồi trnL-e/trnL-f sau khi 
tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình 
tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) 
của Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự của 15 
mẫu Gừng núi đá trong nghiên cứu được so sánh với 
các trình tự gen tham chiếu đã được công bố trên 
NCBI là EU552529.1 Alpinia officinarum (chi Riềng) 
và MF066711.1 Zingiber zerumbet (chi Gừng gió hay 
Gừng dại) thông qua phần mềm MEGA v6.06. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 13 
Bảng 3. Độ dài trình tự của 15 mẫu Gừng núi đá 
nghiên cứu 
STT Kí hiệu 
Tổng số 
nucleotide 
STT Kí hiệu 
Tổng số 
nucleoti
de 
1 GND1 733 9 GND9 734 
2 GND2 734 10 GND10 732 
3 GND3 734 11 GND11 734 
4 GND4 733 12 GND12 734 
5 GND5 734 13 GND13 734 
6 GND6 734 14 GND14 733 
7 GND7 734 15 GND15 734 
8 GND8 732 
Số liệu thu được trong bảng 3 của các mẫu Gừng 
núi đá có độ dài nucleotide là phù hợp với kết quả 
kiểm tra kích thước băng PCR ở hình 1. Kết quả ở 
bảng 3 cũng cho thấy, do có sự mất đoạn hay thêm 
đoạn (InDel) ở một số vị trí trên đoạn gen nên số 
lượng nucleotide tổng số của mỗi đoạn trình tự có sự 
dao động giữa các mẫu nghiên cứu. Hầu hết các mẫu 
đều có chiều dài 734 nucleotide. Ba mẫu GND1, 
GND4 và GND14 có chiều dài 733 nucleotide. Hai 
mẫu GND8 và GND10 có chiều dài là 732 nucleotide. 
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của 15 mẫu 
Gừng núi đá với trình tự của 2 mẫu tham chiếu tương 
ứng trên ngân hàng gen đã được công bố 
(EU552529.1 Alpinia officinarum và MF066711.1 
Zingiber zerumbet) cho thấy 15 mẫu Gừng núi đá có 
độ tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham 
chiếu EU552529.1 Alpinia officinarum (chi Riềng) 
hơn mẫu tham chiếu MF066711.1 Zingiber zerumbet 
(chi Gừng gió). Ở các vị trí 83-91 và 498-505, 15 mẫu 
Gừng núi đá đều tương đồng với mẫu tham chiếu 
EU552529.1 Alpinia officinarum, trong khi đó mẫu 
tham chiếu MF066711.1 Zingiber zerumbet mất 9 
nucleotide và 8 nucleotide, tương ứng. Tương tự ở vị 
trí 569-587, 15 mẫu Gừng núi đá và mẫu tham chiếu 
EU552529.1 Alpinia officinarum đều bị mất 19 
nucleotide so với mẫu tham chiếu MF066711.1 
Zingiber zerumbet. Khi phân tích sắp cột thẳng hàng 
trình tự của 15 mẫu Gừng núi đá với nhau nhận thấy, 
mẫu GND1, GND4, GND8, GND10 và GND14 có 
nhiều vị trí trên chuỗi trình tự có sự thay đổi 
nucleotide so với các mẫu còn lại và so với mẫu tham 
chiếu. 
3.3. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác 
định mối quan hệ di truyền giữa 15 mẫu Gừng núi đá 
nghiên cứu 
Số liệu thu được ở bảng 4 cho thấy có sự tương 
đồng khá cao giữa 15 trình tự của 15 mẫu Gừng núi 
đá nghiên cứu. Hệ số tương đồng di truyền cao nhất 
là 99,87% (giữa mẫu GND15 và GND13) và thấp nhất 
là 93,20% (giữa mẫu GND1 và GND10). Kết quả so 
sánh sự tương đồng di truyền giữa 2 mẫu tham chiếu 
EU552529.1 Alpinia officinarum và MF066711.1 
Zingiber zerumbet với 15 mẫu nghiên cứu cho thấy: 
15 mẫu Gừng núi đá có hệ số tương đồng di truyền 
so với mẫu tham chiếu EU552529.1 dao động từ 
94,65% (mẫu GND14 và EU552529.1) đến 97,83% 
(mẫu GND7 và EU552529.1). 15 mẫu Gừng núi đá có 
hệ số tương đồng di truyền với mẫu tham chiếu 
MF066711.1 Zingiber zerumbet dao động từ 81,66% 
(mẫu GND14 và MF066711.1) đến 84,53% (mẫu 
GND5; GND7 và MF066711.1). Nghiên cứu này đã 
sử dụng marker trnL-e/trnL-f. Đây là vùng trình tự 
ADN lục lạp ngắn có tốc độ tiến hoá rất nhanh 
(Quandt et al., 2004). Do vậy, khi so sánh vùng trình 
tự ADN lục lạp giữa các xuất xứ khác nhau của Gừng 
núi đá cho kết quả sự đa dạng di truyền cao. Ngoài 
ra, 15 mẫu (xuất xứ) Gừng núi đá được thu thập từ 15 
xã thuộc 5 huyện của tỉnh Hà Giang, là tỉnh miền núi, 
địa hình chia cắt có khoảng cách địa lý lớn giữa các 
huyện. Khoảng cách trung bình giữa các huyện thu 
thập mẫu Gừng núi đá là khoảng 100 km. Đặc biệt 
khoảng cách từ huyện Xín Mần đến huyện Mèo Vạc 
là trên 200 km. Sự tiến hoá của các xuất xứ có 
khoảng cách địa lý xa nhau và địa hình chia cắt như 
vậy là cơ sở hình thành sự đa dạng di truyền cao giữa 
các mẫu Gừng núi đá. 
Bảng 4. Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Gừng 
núi đá nghiên cứu và 2 mẫu tham chiếu 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 14 
Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Gừng 
núi đá nghiên cứu với mẫu tham chiếu EU552529.1 
Alpinia officinarum và MF066711.1 Zingiber 
zerumbet 
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa vào phần 
mềm Mega 6.06 theo phương pháp của Nei (1978), 
kết quả từ 15 mẫu Gừng núi đá nghiên cứu được 
phân làm 4 nhóm chính (Hình 2): 
Nhóm thứ I: bao gồm 12 mẫu Gừng núi đá 
(GND6, GND3, GND9, GND7, GND4, GND5, 
GND12, GND15, GND13, GND11, GND2 và GND1). 
Hệ số tương đồng di truyền giữa 12 giống này rất 
cao, dao động từ 95,95% (GND11 và GND1) đến 
99,87% (GND13 và GND15). Hệ số tương đồng giữa 
các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham 
chiếu EU552529.1 Alpinia officinarum dao động từ 
94,85% (GND11 và EU552529.1) đến 97,83% (giữa 
mẫu GND7 và EU552529.1). 
Nhóm thứ II: gồm duy nhất mẫu Gừng núi đá 
GND10, mẫu này có hệ số tương đồng với các mẫu 
còn lại dao động từ 93,20% (GND10 và GND1) đến 
96,84% (GND10 và GND11). Mẫu GND10 có hệ số 
tương đồng 95,39% với gen tham chiếu EU552529.1 
Alpinia officinarum. 
Nhóm thứ III: gồm duy nhất mẫu Gừng núi đá 
GND8, mẫu này có hệ số tương đồng với các mẫu 
còn lại dao động từ 94,90% (GND8 và GND14) đến 
97,65% (GND8 và GND2). Mẫu GND8 có hệ số tương 
đồng 97,29% với gen tham chiếu EU552529.1 Alpinia 
officinarum. 
Nhóm thứ IV: gồm duy nhất mẫu Gừng núi đá 
GND14, mẫu này có hệ số tương đồng với các mẫu 
còn lại dao động từ 93,86% (GND14 và GND1) đến 
96,99% (GND14 và GND11). Mẫu GND14 có hệ số 
tương đồng 94,65% với gen tham chiếu EU552529.1 
Alpinia officinarum. 
Kết quả thu được ở hình 2 cũng phù hợp với các 
kết quả so sánh trình tự các nucleotide vùng gen lục 
lạp của 15 mẫu Gừng núi đá khi phân tích sắp cột 
thẳng hàng và so sánh với trình tự gen tham chiếu đã 
được công bố trên ngân hàng gen thế giới. Như vậy 
sử dụng marker trnL-e/trnL-f khuếch đại vùng lục 
lạp và dựa vào trình tự nucleotide vùng lục lạp đã 
được khuếch đại có thể thấy 15 mẫu Gừng núi đá 
tương đồng với loài Alpinia officinarum (thuộc chi 
Riềng, họ Gừng rất cao, dao động từ 94,65% (giữa 
mẫu GND14 và EU552529.1) đến 97,83% (giữa mẫu 
GND7 và EU552529.1). 
3.4. Kết quả nhận dạng một số mẫu giống Gừng 
núi đá nghiên cứu 
Sự sai khác về nucleotide giữa các mẫu Gừng núi 
đá với giống tham chiếu được thể hiện ở hình 3 cho 
thấy có nhiều vị trí biến đổi nucleotide giữa các mẫu 
giống Gừng núi đá với giống tham chiếu Alpinia 
officinarum. Tuy nhiên, dựa vào các vị trí biến đổi 
nucleotide cá biệt chỉ có thể nhận dạng được 5 mẫu 
giống Gừng núi đá là GND1, GND4, GND8, GND10 
và GND14. 
Mẫu giống GND1 có sự biến đổi nucleotide ở 
các vị trí 667 (T biến đổi thành A); vị trí 696 (A biến 
đổi thành C); 700 (A biến đổi thành T) so với giống 
tham chiếu Alpinia officinarum. Mẫu giống GND4 
mất nucleotide A ở vị trí 128 so với giống tham chiếu. 
Mẫu giống GND8 có sự biến đổi nucleotide ở các vị 
trí 55 (T biến đổi thành G); vị trí 174 (A biến đổi 
thành C); 677 (T biến đổi thành C). 
Tương tự, mẫu giống GND10 có sự biến đổi 
nucleotide ở các vị trí 65, 157 (T biến đổi thành A), vị 
trí 128, 151 (A biến đổi thành G), vị trí 196, 270 (G 
biến đổi thành A), vị trí 253 (A biến đổi thành T) và 
vị trí 269 (G biến đổi thành C). Mẫu giống GND14 có 
sự biến đổi nucleotide ở các vị trí 74 (C biến đổi 
thành G); vị trí 152 (T biến đổi thành A); vị trí 162-
164 (CTA biến đổi thành GGG); vị trí 197 (C biến đổi 
thành G), vị trí 211 (G biến đổi thành C), vị trí 212 (C 
biến đổi thành T) và vị trí 207, 213, 217, 258, 259 (A 
biến đổi thành T). 
Như vậy dựa vào trình tự nucleotide vùng lục lạp 
với marker trnL-e)/trnL-f có thể nhận dạng được 5 
mẫu giống Gừng núi đá là GND1, GND4, GND8, 
GND10 và GND14 so với giống tham chiếu Alpinia 
officinarum (EU552529.1). 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 15 
Hình 3. Các nucleotide sai khác giữa các mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu EU552529.1 Alpinia officinarum 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 16 
4. KẾT LUẬN 
Đã giải trình tự và xác định được 15 đoạn trình 
tự của 15 mẫu lá Gừng núi đá được thu thập từ 15 xã 
của 5 huyện thuộc tỉnh Hà Giang có sự tương đồng 
từ 94,65% đến 97,83% với mẫu tham chiếu đã được 
công bố trên NCBI (EU552529.1 Alpinia 
officinarum). 
Đã xác định được mức tương đồng di truyền của 
15 mẫu Gừng núi đá nghiên cứu rất cao, dao động từ 
93,20% (GND1 và GND10) đến 99,87% (GND15 và 
GND13). Dựa vào cây quan hệ phát sinh của 15 mẫu 
Gừng núi đá nghiên cứu và mẫu tham chiếu được 
chia làm 4 nhóm chính. Trình tự nucleotide vùng lục 
lạp với marker trnL-e/trnL-f có thể nhận dạng được 5 
mẫu giống Gừng núi đá là GND1, GND4, GND8, 
GND10 và GND14 so với giống tham chiếu Alpinia 
officinarum (EU552529.1). Kết quả nghiên cứu này là 
cơ sở quan trọng trong định hướng bảo tồn và phát 
triển nguồn gen Gừng núi đá có tính đa dạng di 
truyền cao tại 5 huyện của tỉnh Hà Giang. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Trần Công Luận, Đỗ Văn Mãi, Vũ Thị Bình 
(2016). Dược liệu học. Giáo trình đào tạo Dược sỹ, 
Trường Đại học Tây Đô. 
2. Bordoloi AK, Sperkova J and Leclercq PA 
(1999). Essential Oils of Zingiber cassumunar Roxb. 
From Northeast India. J. Essent. Oil Res., 11, pp. 441-
445. 
3. Christine S (2007). Clonal propagation 
of Curcuma zedoaria rocs and Zingiber zerumbet, 
PhD thesis, University Sains Malaysia. 
4. Doyle J J and Doyle JL (1987). A rapid DNA 
isolation procedure from small quantities of fresh leaf 
tissues. Phytochem Bull, 19, pp. 11–15. 
5. Kasarkar A, Kulkarnil D, Dhudade P and Sabu 
M (2017). New Report on Zingiber montanum (K.D. 
Koenig) Link. From Kudal, Dist. Sindhudurg, (MS) 
India, Bioscience Discovery, 8(2), pp. 270-273. 
6. Nalawade SM, Sagare AP, Lee C, Kao C and 
Tsay H (2003). Studies on tissue-culture of Chinese 
Medicinal plant resources in Taiwan and their 
sustainable utilization, Bot. Bull. Acad. Sin, 44, pp. 
79–98. 
7. Nei M (1978). Estimation of average 
heterozygosity and genetic distance from a small 
number of individuals. Genetics, 89, pp. 583–590. 
8. Quandt D, Müller K, Stech M, Hilu K, Frey W, 
Frahm J & Borsch T (2004). Molecular evolution of 
the chloroplast TRNL-F region in land plants. In 
Monogr Syst Bot Missouri Bot Gard , 98, pp. 13–37. 
 GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OF Zingiber purpureum Roscoe BY MOLECULAR MARKERS 
Duong Van Thao1 
1Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry 
Summary 
Genetic diversity analysis of Zingiber purpureum Roscoe is essential for conservation, management and 
breeding. Marker trnL-e/trnL-f was used to amplify chloroplast sequences of 15 accessions of Zingiber 
purpureum Roscoe collected from 15 communes of 5 districts of Ha Giang province. The results showed 
that 15 sequential segments of 15 accessions of Zingiber purpureum Roscoe had similarities from 94.65% to 
97.83% compared to the reference segment of Alpinia officinarum published on NCBI (EU552529.1). The 
genetic similarity level of 15 accessions of Zingiber purpureum Roscoe is very high, ranging from 93.20% 
(GND1 and GND10) to 99.87% (GND15 and GND13). The phylogenetic tree which constructed from 15 
sequential segments of 15 accessions of Zingiber purpureum Roscoe and 2 reference segments of Alpinia 
officinarum and Zingiber zerumbet is divided into four main groups. The chloroplast nucleotide sequence 
amplified by marker trnL-e/trnL-f can identify 5 varieties of Zingiber purpureum Roscoe (GND1, GND4, 
GND8, GND10 and GND14). 
Keywords: Genetic diversity, genetic resources, genetic similarity, Ha Giang, Zingiber purpureum Roscoe. 
Người phản biện: PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 
Ngày nhận bài: 25/9/2020 
Ngày thông qua phản biện: 26/10/2020 
Ngày duyệt đăng: 02/11/2020