Chọn lọc các dòng bông (Gossypium hirsutum L.) chuyển gen bar chống chịu thuốc

 - 25% diện
tích lá bị hoại tử
Chống chịu kém (++): > 25 - 50% diện tích lá
bị hoại tử
Chống chịu rất kém (+): > 50% diện tích lá bị
hoại tử
2.2.7. Di truyền tính chống chịu thuốc diệt cỏ
trong cây bông chuyển gen
Dòng bông chuyển gen bar B9 và BF17 được lai
tạo F1, F2 và BC1F1 qua 2 bước: Bước 1, hai dòng
được lai với MCU9 (giống thuần thường dùng làm
mẹ cho các giống lai) tạo F1, sau đó tự thụ tạo F2
và lai trở lại với MCU9 tạo BC1F11. Bước 2, B9
và BF17 được lai với giống nền không chuyển gen
Coker310, sau đó tự thụ tạo F1, F2 và lai tạo BC1
được tạo tương tự như trên. Phun Basta (0,6 kg
ai./ha) lên cây con ở giai đoạn 7 - 8 lá. Theo dõi
cây con sống/chết ở giai đoạn 7 ngày sau phun,
tỷ lệ sống: chết được dùng để phân tích sự phân
ly của gen chuyển.
2.2.8. Đặc điểm nông sinh học và hình thái
Thu thập theo phương pháp IPGRI và quy
phạm khảo nghiệm DUS của ngành bông, so
sánh với đặc điểm giống gốc. Trong đó, thời gian
phát dục qua các giai đoạn, tỷ lệ mọc, sức nảy
mầm và các đặc điểm hình thái được theo dõi 20
cây/hàng/dòng. Các chỉ tiêu còn lại được theo
dõi 10 cây trong số 20 cây trên (đo đếm cách cây,
trừ cây đầu hàng và cây mất ngọn).
3. Kết Quả và Thảo Luận
3.1. Chọn lọc các dòng chuyển gen bar thế hệ
T1
Bảng 1 thể hiện kết quả của 17 dòng bông chọn
được từ 116 dòng bằng thử tính chống chịu thuốc
diệt cỏ (Hình 1). Các cây bông chọn được đánh
giá sự hiện diện của gen chuyển bảng PCR (Hình
2A), xác định số bản sao gen chuyển bằng South-
ern blot (Hình 2B, C) và xác định sự biểu hiện
của gen chuyển bằng Northern blot (Hình 2D).
Xử lý Basta 15SL (nồng độ 0,6 kg ai./ha) ở giai
đoạn 4 - 5 lá cho 47 dòng mang gen pCB301: bar
thu được 18 dòng có cây chống chịu glufosinate,
nhưng tỷ lệ cây sống rất thấp. Mức độ chống chịu
của các dòng đều từ yếu - trung bình (cây có
khả năng phục hồi). Năm dòng chọn CB3, CB15,
CFB2, CFB6 và CFB18 có tỷ lệ sống 7,1 - 21,4%
(Bảng 1) và mức độ chống chịu tốt hơn cả và cây
dễ hồi phục (Hình 1E).
Xử lý Basta 15SL (nồng độ 0,6 kg ai./ha) ở
giai đoạn 4 - 5 lá cho 69 dòng T1 chuyển gen
pCAMBIA: bar thu được 48 có cây chống chịu
glufosinate ở mức trung bình- rất cao. 12 dòng
chọn (Bảng 1) có tỷ lệ cây sống 32,4 - 81,4%, cây
chống chịu rất cao (Hình 1F). Đối với các dòng
có tỷ lệ sống: chết xấp xỉ 3:1 tương đương tỷ lệ
dự kiến cho một gen trội duy nhất trong quần
thể tự thụ phấn.
Việc áp dụng một loại thuốc diệt cỏ như glu-
fosinate có thể gây ra các phản ứng nhạy cảm
khác nhau trong cỏ dại, chủ yếu là do tính biến
đổi di truyền rộng của chúng. Sự nhạy cảm khác
nhau có thể được giải thích bằng sự khác biệt
trong chuyển vị, hấp thu và chuyển hóa thuốc
diệt cỏ (Everman & ctv., 2009). Bên cạnh đó, các
yếu tố dẫn đến di truyền phi Mendel là kiểu gen
cây biến đổi do phương pháp chuyển gen, bất
thường nhiễm sắc thể, allen không tương đồng,
do sự tích hợp gen chuyển không ổn định hoặc
im lặng gen chuyển, có thể do tương tác giữa gen
chuyển và genome cây nhận (truyền gen kém, trao
đổi chéo, không tương hợp nên không có đồng hợp
tử) (Zhang & ctv., 2005).
Để chắc chắn tính chống chịu thuốc diệt cỏ
Basta được tạo ra bởi gen chuyển cần kiểm tra
sự có mặt của gen bar, kết quả là gen bar có mặt
trong cây chuyển gen thế hệ T1 (Hình 2A). Kiểm
tra sự gắn kết của gen chuyển bằng Southern blot
cho thấy 10 dòng chuyển gen giả định là CB3,
CB15, CFB2, CFB6, CFB16, B1, B6, B9, B18 và
BF17 mang 1 bản sao, 2 dòng B2, B4 mang 2 bản
sao. Trên đối chứng không chuyển gen Coker310,
không phát hiện băng lai (Hình 2B, C). Kết quả
này cũng xác nhận kết quả PCR và chỉ ra sự tích
hợp của vùng T-DNA trong gemome cây chuyển
gen. Sự xuất hiện băng lai giữa mẫu dò là cDNA
từ cây chuyển gen với RNA tổng số của 6 dòng
CB3, CB5, B2, B8, B9 và BF17 (Hình 2D) cho
thấy có hoạt động phiên mã của gen chuyển.
Thử nghiệm sinh học về khả năng chịu thuốc
diệt cỏ ở cả cây chuyển gen và không chuyển gen
thế hệ T2 cũng được áp dụng với Basta 15SL.
Lá của những cây không được biến đổi gen bị
cháy (Hình 3C), trong khi những cây của cây
biến đổi gen không có triệu chứng như vậy (Hình
3B). Hình 3A cho thấy, trước khi phun thuốc cây
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 75
Bảng 1. Số cây mọc, số cây sống, tỷ lệ (%) cây chống chịu Basta 15SL của 12 dòng bông chọn
TT Dòng bông Số cây mọc Số cây sống Tỷ lệ cây sống (%) Mức độ
1 CB3 112 8 7,1 +++
2 CB15 95 11 11,6 +++
3 CFB2 73 11 15,1 +++
4 CFB6 107 15 14,0 +++
5 CFB18 42 9 21,4 +++
1 B1 132 82 62,1 +++++
2 B2 16 13 81,3 ++++
3 B3 84 59 70,2 +++++
4 B4 42 34 81,4 ++++
5 B6 66 45 68,2 ++++
6 B9 198 142 71,7 +++++
7 B18 111 36 32,4 +++++
8 B20 36 32 62,8 ++++
9 BF8 102 52 51,0 +++++
10 BF12 91 36 39,6 ++++
11 BF17 82 42 51,2 +++++
12 BF25 42 30 71,4 +++
Coker310 35 0 0 -
Hình 1. Cây bông chuyển gen bar thế hệ T1 trước và sau khi xử lý thuốc diệt cỏ cỏ Basta 15SL (nồng độ
0,6 kg ai./ha), triệu chứng sau xử lý 5 ngày ở giai đoạn 4 - 5 lá.
A: Trước khi xử lý; B: Sau xử lý thuốc diệt cỏ; C: Cây không chống chịu; D, E: Cây chống chịu thuốc diệt
cỏ ở mức kém; F: Cây chống chịu thuốc diệt cỏ ở mức cao; và G: đối chứng không chống chịu.
bông và cỏ phát triển rất tốt, sau phun Basta với
nồng độ 0,6 kg ai./ha làm cho cỏ và đối chứng là
Coker310 chết hoàn toàn (Hình 3C) và cây bông
không bị ảnh hưởng (Hình 3B). Mức độ chống
chịu của các dòng có khác nhau, chống chịu cao
(Hình 3D) và chống chịu trung bình (Hình 3E).
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5)
76 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Hình 2. Đánh giá các dòng bông chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
A: Sản phẩn PCR gen bar trong cây chuyển gen. M: thang DNA chuẩn; (+): plasmid pCAMBIA1300: bar ;
(-): Coker310; 1-24 cây chuyển gen.
B: Southern blot. (M): thang DNA chuẩn 1kb; P: plasmid pCB301: bar/PstI (+) EcoRI; 1: (-) Coker310;
CB3, CB15, CFB2, CFB6 và CFB18: dòng chuyển gen.
C: Southern blot. (M): thang DNA chuẩn; P: plasmid pCAMBIA: bar/PstI (+) EcoRI; B1, B2, B4, B6,
B9, B18 và BF17: dòng chuyển gen; (-): Coker310.
D: Northern blot. (M): thang RNA chuẩn 0,5 kb; CB3, CB5, B2, B8, B9 và BF17: dòng chuyển gen; (-):
Coker310.
Hình 3. Dòng bông chuyển gen bar thế hệ T2 xử lý Basta ở giai đoạn 7 - 8 lá, liều lượng 0,6 kg a.i/ha. (A)
trước khi phun, (B) sau phun 7 ngày.
Năm dòng B1, B9, B18 và BF8, BF17 thể hiện
mức độ chống chịu cao và ổn định.
3.2. Di truyền tính chống chịu thuốc diệt cỏ
của các dòng chuyển gen bar
Để làm sáng tỏ sự di truyền tính trạng chịu
thuốc diệt cỏ của dòng B9 và BF17, phân
tích di truyền cho tính trạng này đã được
thực hiện. Các tổ hợp lai F1 được tạo ra là
B9ÖMCU9, MCU9ÖB9, B9ÖCoker310 và Coker
310ÖB9 chống chịu hoàn toàn với glufosinate
(Bảng 2). Chứng tỏ rằng tính trạng chống chịu là
trội và không bị ảnh hưởng bởi di truyền theo
dòng mẹ (Zhang & ctv., 2005). Quần thể F2
B9ÖMCU9 phân ly theo tỷ lệ chuẩn 3:1. Phân ly
sống chết ở quần thể F2 từ cặp lai Coker310 ÖB9
cũng đã xác nhận tỷ lệ xấp xỉ 3:1 (χ2 = 0.008).
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 77
Bảng 2. Phân ly tính chống chịu thuốc diệt cỏ của dòng bông B9
TT Cặp lai Tổng cây Tỷ lệ cây sống (%) Tỷ lệ phân ly
sống: chết
χ2
1 B9 Ö MCU9 (F1) 30 100
2 MCU9 Ö B9 (F1) 96 100
3 B9 Ö Coker 310 (F1) 52 100
4 Coker310 Ö B9 (F1) 37 100
5 B9 Ö MCU9 (F2) 48 75,0 3,00 0,000
6 MCU9 Ö B9 (F2) 51 76,5 3,25 0,059
7 B9 Ö Coker 310 (F2) 43 76,7 3,30 0,070
8 Coker310 Ö B9 (F2) 43 74,4 2,91 0,008
9 (B9 Ö MCU9) Ö MCU9 43 51,2 1,05 0,023
10 (B9 Ö Coker 310) Ö Coker 310 41 51,2 1,05 0,024
P0,05 = 3,841.
Bảng 3. Phân ly tính chống chịu thuốc diệt cỏ của dòng bông BF17
TT Cặp lai Tổng cây Tỷ lệ cây sống (%) Tỷ lệ phân
ly sống: chết
χ2
1 BF17 Ö MCU9 (F1) 53 100
2 MCU9 Ö BF17 (F1) 75 100
3 BF17 Ö Coker 310 (F1) 37 100
4 Coker310 Ö BF17 (F1) 71 100
5 BF17 Ö MCU9 (F2) 49 77,6 3,45 0,170
6 MCU9 Ö BF17 (F2) 43 72,1 2,58 0,194
7 BF17 Ö Coker 310 (F2) 55 76,4 3,23 0,055
8 Coker310 Ö BF17 (F2) 33 78,8 3,71 0,253
9 (BF17 Ö MCU9) Ö MCU9 38 52,6 1,11 0,105
10 (BF17 Ö Coker 310) Ö Coker 310 43 51,2 1,05 0,023
P0,05 = 3,841.
Tỷ lệ phân ly của quần thể hồi giao BC1F1
(B9 Ö MCU9) Ö MCU9 và (B9 Ö Coker310) Ö
Coker310 đều là 1:1, khi phân tích χ2. Như vậy,
kết quả từ các cặp lai khác nhau đều chỉ ra mô
hình di truyền đơn gen.
Kết quả ghi nhận ở Bảng 3 cho tỷ lệ phân ly
sống: chết phù hợp dự đoán ở F2 là 3:1 và BC1F1
là 1:1, giá trị 2 đều nằm trong khoảng cho phép.
Do đó, dòng BF17 cũng có mô hình di truyền đơn
gen.
Kết quả phân ly tính kháng hỗ trợ kết luận cas-
sette biểu hiện protein bar trong 2 dòng bông B9
và BF17 là một bản sao phù hợp cho mục tiêu tạo
giống chống chịu thuốc trừ cỏ gốc glufosinate. Bởi
vì dòng Coker không được trồng phổ biến, tính
trạng chống chịu phải được chuyển qua các giống
có năng sất cao hơn, thích nghi tốt hơn bằng
phương pháp lai trở lại (Perlak & ctv., 1990).
Kết quả này cũng khẳng định, gen chuyển trong
dòng B9 và BF17 đã ở dạng đồng hợp tử, phù
hợp với mục tiêu lai tạo.
3.3. Di truyền gen chuyển và đặc điểm nông
sinh học của cây chuyển gen thế hệ T2
Các đánh giá về kiểu hình, đặc điểm nông học
giữa cây trồng chuyển gen và cây trồng truyền
thống không chuyển gen có thể hỗ trợ kết luận
có hay không nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại
có thể xâm lấn của cây trồng chuyển gen so với
cây trồng truyền thống. Trong trường hợp dữ
liệu thu được cho thấy không có sự sai khác về
các đặc tính đánh giá thì có thể kết luận là cây
trồng chuyển gen không làm tăng cường nguy cơ
trở thành cỏ dại so với cây trồng truyền thống
(OECD, 2008).
Kết quả trong Bảng 4 cho thấy không có sự
khác biệt (P ≥ 0,055) giữa các dòng bông chuyển
gen bar (B9 và BF17) với đối chứng Coker310 về
các đặc điểm nông sinh học, gồm tỷ lệ nảy mầm,
sức mọc mầm, thời gian sinh trưởng từ gieo đến
nở hoa, thời gian sinh trưởng từ gieo đến nở quả,
số cành quả/cây, số cành đực/cây, vị trí cành quả
1, khối lượng quả, số quả/cây. Có sự đồng nhất về
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5)
78 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Bảng 4. Đặc điểm nông học, hình thái và tính mẫn cảm với bệnh hại của các dòng bông chuyển gen bar với
giống bông nền Coker310
TT Chỉ tiêu theo dõi B9 BF17 Coker310 P
1 Tỷ lệ nảy mầm (%) 90,4 92,7 90,4 0,678
2 Thời gian từ gieo đến nở quả (ngày) 102,3 104,3 104,0 0,089
3 Số cành quả/cây 8,9 8,9 9,5 0,148
4 Số cành đực/cây 1,6 2,0 2,0 0,084
5 Chiều cao cây (cm) 115,5 120,5 112,5 0,061
6 Hình dạng thân Hình tháp Hình tháp Hình tháp -
7 Màu sắc thân Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh nhạt -
8 Màu sắc lá Xanh TB Xanh TB Xanh TB -
9 Màu sắc cánh hoa Trắng ngà Trắng ngà Trắng ngà -
10 Màu sắc phấn hoa Trắng ngà Trắng ngà Trắng ngà -
11 Khối lượng quả (g) 4,9 5,0 4,9 0,289
12 Số quả/cây 10,4 10,6 11,6 0,148
các đặc điểm hình thái (chiều cao cây, hình dạng
thân, màu sắc thân, hình dạng lá, màu sắc lá,
màu sắc cánh hoa, màu sắc phấn hoa, hình dạng
quả) giữa các dòng bông chuyển gen bar với giống
nền Coker310.
Trong nghiên cứu này, phân tích PCR và
Southern blot chứng minh đã tích hợp thành
công gen bar vào genome Coker310, phân tích
Northern blot khẳng định có sự biểu hiện của
gen chuyển. Thử Basta cho thấy các dòng bông
chuyển gen có mức độ chống chịu cao với glufos-
inate. Đánh giá thêm các đặc điểm thực vật và
nông học trong cả B9, BF17 và giống nền chỉ ra
không có sự khác biệt đáng kể. Ngoài ra, nghiên
cứu phân tích tính di truyền đã xác nhận rằng gen
bar phân ly theo quy luật Mendel cho đơn tính
trạng. Phát hiện này phù hợp với (Khan & ctv.,
2009; Perlak & ctv., 1990; Zhang & ctv., 2005).
4. Kết Luận
Tính chống chịu thuốc diệt cỏ glufosinate của
các dòng bông chuyển gen được duy trì qua các
thế hệ T1 và T2.
Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen bar B1, B9,
B18 và BF8, BF17 mang 1 bản sao, có hoạt động
phiên mã của gen chuyển, cây sinh trưởng đồng
đều và có mức độ chống chịu thuốc diệt cỏ glu-
fosinate cao (0,6 kg ai./ha).
Hai dòng bông chuyển gen T2 là B9 và BF17
mang 01 bản sao gen, di truyền gen chuyển theo
quy luật Mendel, chống chịu cao với thuốc trừ
cỏ Basta ở nồng độ 0,6 kg ai./ha, không sai khác
về đặc điểm thực vật học so với giống bông nền
Coker310 không chuyển gen.
Lời Cam Đoan
Chúng tôi cam đoan không có bất kỳ mâu
thuẫn nào giữa các tác giả.
Lời Cảm Ơn
Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài “Nghiên
cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ
bằng kỹ thuật chuyển gen”, mã số KC.06.11/11-
15.
Tài Liệu Tham Khảo (References)
Elbaidouri, M., Chaparro, C., & Panaud, O. (2013). Use
of next generation sequencing (NGS) technologies for
the genome-wide detection of transposition. Methods
in Molecular Biology 1057, 265-274.
Everman, W. J., Thomas, W. E., Burton, J. D., York,
A. C., & Wilcut, J. W. (2009). Absorption, translo-
cation, and metabolism of glufosinate in transgenic
and nontransgenic cotton, Palmer amaranth (Amaran-
thus palmeri), and pitted morning glory (Ipomoea la-
cunosa). Weed Science 57(4), 357-361.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United
Nations). (2018). Cotton area harvested and pro-
duction quality. Retrieved June 12, 2020, from
ageID=567.
Khan, D., Variath, M., Ali, S., Jamil, M., Khan, M., Shafi,
M., & Shuijin, Z. (2009). Genetic transformation of bar
gene and its inheritance and segregation behavior in
the resultant transgenic cotton germplasm (BR001).
Pakistan Journal of Botany 41, 2167-2178.
Li, H., Luo, J., Hemphill, J. K., Wang, J. T., & Gould,
J. H. (2001). A rapid and high yielding DNA miniprep
for cotton (Gossypium spp.). Plant Molecular Biology
Reporter 19, 1-5.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 79
Nha, T. N., Anh, T. V. T., Trang, T. X. V., Trinh, N.
U. N., Hai, H. P., Ngoc, B. P., Tri, M. B., Kiem, T.
P., & Hop, M. T. (2016). Efficiency of herbicide resis-
tant gene transformation via A. tumefaciens in cotton
plant (Gossypium hirsutum L.). Sciene and Technol-
ogy Journal of Agriculture and Rural Development 16,
10-19.
OECD (Organization for Economic Cooperation and
Development). (2008). Consensus document on the
biology of cotton (Gossypium spp.). Paris, France:
Organization for Economic Cooperation and Develop-
ment.
Perlak, F. J., Deaton, R. W., Armstrong, T. A., Fuchs, R.
L., Sims, S. R., Greenplate, J. T., & Fischhoff, D. A.
(1990). Insect resistant cotton plants. Bio/Technology
8(10), 939-943.
USDA (United States Department of Agriculture).
(2019). Cotton sector at a glance. Retrieved February
12, 2020, from https://www.ers.usda.gov/.
Zhang, Y., Yin, X., Yang, A., Li, G., & Zhang, J. (2005).
Stability of inheritance of transgenes in maize (Zea
mays L.) lines produced using different transformation
methods. Euphytica 144(1), 11-22.
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 19(5)