Cải biến và thiết kế vector biểu hiện các gen cry1Ia có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương Etiella zinkenella

mã 
hóa 
cry1Ia
-wt 
cry1Ia-
cb 
GCA (A) 22 10 GCC (A) 6 12 GCG (A) 4 5 GCT (A) 12 17 
TGC (C) 0 1 TGT (C) 2 1 GAC (D) 8 13 GAT (D) 26 21 
GAA (E) 28 25 GAG (E) 15 18 TTC (F) 13 19 TTT (F) 24 18 
GGA (G) 21 10 GGC (G) 2 12 GGG (G) 7 7 
GGT 
(G) 
14 15 
CAC (H) 0 9 CAT (H) 19 10 ATA (I) 12 11 ATC (I) 7 11 
ATT (I) 23 20 AAA (K) 23 21 AAG (K) 8 10 TTA (L) 27 8 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 36 
TTG (L) 8 10 CTA (L) 14 8 CTC (L) 3 18 CTG (L) 3 5 
CTT (L) 7 13 ATG (M) 11 11 AAC (N) 10 21 AAT (N) 37 26 
CCA (P) 14 9 CCC (P) 0 8 CCG (P) 7 3 CCT (P) 8 9 
CAA (Q) 24 18 CAG (Q) 5 11 AGA (R) 13 12 AGG (R) 6 10 
CGA (R) 8 4 CGC (R) 2 4 CGG (R) 0 2 CGT (R) 6 3 
AGC (S) 7 6 AGT (S) 14 14 TCA (S) 17 8 TCC (S) 1 11 
TCG (S) 2 7 TCT (S) 20 15 ACA (T) 31 18 ACC (T) 4 16 
ACG (T) 8 4 ACT (T) 15 20 GTA (V) 22 2 GTC (V) 5 11 
GTG (V) 6 16 GTT (V) 14 18 TGG (W) 12 12 TAC (Y) 3 13 
TAT (Y) 29 19 TAA (.) 0 0 TGA (.) 0 0 TAG (.) 1 1 
Ngoài ra, khi phân tích các vùng bảo thủ 
(conserved domains) của cả gen cry1Ia dạng dại và 
cải biến đều cho thấy sự tương đồng về vùng bảo thủ 
endotoxin_N, endotoxin_M, và delta_endotoxin_C 
của chúng (Hình 2). Điều này cho thấy, gen cry1Ia 
dạng dại và cải biến tuy có sự sai khác về các bộ ba 
mã hóa nhưng trình tự và đặc tính của protein cry1Ia 
không thay đổi. Gen cry1Ia dạng dại và cải biến được 
sử dụng để thiết kế các vector biểu hiện thực vật 
phục vụ công tác chuyển gen vào cây đậu tương. 
Hình 2. Kết quả phân tích các vùng bảo thủ của gen cry1Ia dạng dại và cải biến 
3.2. Tổng hợp nhân tạo và tách dòng gen cry1Ia 
cải biến 
Hình 3. Kết quả tách dòng gen cry1Ia cải biến 
Chú thích: (A) Kết quả PCR khuẩn lạc của 
vector tách dòng pUC19 chứa gen cry1Ia cải biến. M, 
PSA DNA Ladder; 1-12: sản phẩm PCR của 12 khuẩn 
lạc 
Gen cry1Ia sau khi cải biến thành công và bổ 
sung thêm vị trí của enzyme giới hạn NcoI và SmaI 
lần lượt vào phía trước đầu 5’ và 3’ được tổng hợp 
nhân tạo theo quy trình và phương pháp của Công ty 
Sinh hóa Phù Sa. Sản phẩm khuếch đại của gen 
cry1Ia cải biến sau khi tổng hợp nhân tạo được gắn 
vào vector pUC19. Tiếp theo, vector tách dòng 
pUC19 có chứa đoạn gen cry1Ia cải biến được biến 
nạp vào E. coli. Các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi 
trường LB đặc có chứa 100 mg/L kháng sinh 
Ampicillin được lựa chọn để kiểm tra bằng PCR với 
cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1). 
Kết quả PCR khuẩn lạc cho thấy, trong tổng số 
12 khuẩn lạc đã được lựa chọn có 3 khuẩn lạc cho kết 
quả dương tính với cặp mồi của vector pUC19 và có 
kích thước khoảng 2100 bp tương ứng với kích thước 
dựa đoán của gen cry1Ia cải biến ban đầu (Hình 3). 
Các khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng để 
giải trình tự. Kết quả cho thấy, cả 3 khuẩn lạc có 
chứa plasmid tái tổ hợp với vùng trình tự hoàn toàn 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 37 
chính xác của gen cry1Ia cải biến đã thiết kế ban đầu 
(Bảng 2). 
3.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry1Ia 
dạng dại và cải biến 
Để thiết kế vector biểu hiện mang các gen 
cry1Ia quan tâm, đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải 
biến được nhân lên bằng kỹ thuật PCR từ DNA 
plasmid của vector tách dòng có chứa các đoạn gen 
tương ứng. Sản phẩm PCR của các đoạn gen cry1Ia 
dạng dại và cải biến được xử lý với enzyme giới hạn 
NcoI và SmaI và ghép nối vào vector pRLT2 (đã được 
xử lý với enzyme giới hạn tương ứng) (Hình 1A và 
4B). Sản phẩm của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia 
dạng dại và cải biến được biến nạp vào E. coli và nuôi 
qua đêm ở 37oC trên đĩa môi trường LB có bổ sung 
100 mg/L kháng sinh Ampicillin. Các khuẩn lạc mọc 
trên đĩa LB được lựa chọn để kiểm tra PCR với các 
cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại và cải biến 
(Bảng 1). 
Hình 4. Kết quả khuếch đại gen cry1Ia dạng dại và cải 
biển và xử lý vector pRLT2 bằng enzyme giới hạn 
Chú thích: (A) Kết quả PCR gen cry1Ia dạng dại 
từ DNA plasmid pJET1.2:cry1Ia dạng dại. (B) Kết quả 
PCR gen cry1Ia cải biến từ DNA plasmid 
pUC19:cry1Ia cải biến. (C) Kết quả cắt vector pRTL2 
bằng 2 enzyme giới hạn NcoI và SmaI. (D) Kết quả 
PCR gen cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector 
pRTL2:cry1Ia dạng dại. (E) Kết quả PCR gen cry1Ia 
cải biến từ khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia cải biến. 
(F) Cấu trúc cassette của 35S:cry1Ia dạng dại và cải 
biến. p1, DNA plasmid của vector pJET1.2:cry1Ia dạng 
dại; -, đối chứng âm H2O; M1, GeneRuler 1kb DNA 
ladder; M2, 1Kb DNA Ladder; p2, DNA plasmid của 
vector pUC19:cry1Ia cải biến; p3, Vector pRTL2; 1-4, 
Khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia dạng dại; +1, Đối 
chứng dương từ DNA plasmid của vector 
pJET1.2:cry1Ia dạng dại; +2, Đối chứng dương từ DNA 
plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 5-8, Khuẩn 
lạc của vector pRTL:cry1Ia cải biến. 
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, các 
khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với gen cry1Ia 
dạng dại và cải biến (Hình 4D-E). Như vậy, việc nối 
đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào vector 
pRTL2 bước đầu đã thành công. Để kiểm tra lại sản 
phẩm ghép nối vào vector pRTL2, các khuẩn lạc 
dương tính được nuôi tăng sinh khối, tách chiết DNA 
plasmid và giải trình tự. 
Kết quả giải trình tự các khuẩn lạc của vector tái 
tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến cho thấy, 
trình tự của gen cry1Ia dạng dại và cải biến hoàn 
toàn không có sự sai khác so với trình tự ban đầu và 
các gen này cùng chiều và được điều khiển bởi 
promoter 35S (Bảng 2; hình 4F). 
Hình 5. Kết quả thiết kế vector pZY101:35S:cry1Ia 
dạng dại và cải biến 
Chú thích: (A) Kết quả cắt vector pZY101-Asc 
bằng enzyme giới hạn HindIII. (B) Kết quả PCR gen 
cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector 
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại. (C) Kết quả PCR gen 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 38 
cry1Ia cải biến từ khuẩn lạc của vector 
pZY101:35S:cry1Ia cải biến. M, GeneRuler 1kb DNA 
ladder; P, vector pZY101-Asc cắt; (-), Đối chứng âm 
H2O; 1, Đối chứng dương từ DNA plasmid của vector 
pJET1.2:cry1Ia dạng dại; 2-5, Khuẩn lạc của vector 
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại; 6, Đối chứng dương từ 
DNA plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 7-10, 
Khuẩn lạc của vector pZY101:35S:cry1Ia cải biến. 
Sau khi chuyển thành công đoạn gen cry1Ia 
dạng dại và cải biến vào vector pRTL2, các cấu trúc 
35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được cắt từ từ vector 
tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến bằng 
enzyme giới hạn HindIII và ghép nối vào vector biểu 
hiện thực vật pZY101-Asc (cũng đã cắt mở vòng và 
xử lý ở cùng vị trí enzyme giới hạn) (Hình 1B và 5A) 
bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm nối của 
vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải 
biến được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 
và nuôi qua đêm trên đĩa môi trường LB có bổ sung 
kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L và Streptomycin 
50 mg/L ở 37oC. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường 
LB có bổ sung kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra 
bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu 1Iawt-NcoI-
F/1Iawt-SmaI-R và 1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R cho 
gen cry1Ia dạng dại và cải biến (Bảng 1). 
Kết quả cho thấy, hầu hết các khuẩn lạc đều cho 
kết quả dương tính với các cặp mồi đặc hiệu của gen 
cry1Ia dạng dại và cải biến (Hình 5B-C). Như vậy, đã 
bước đầu thiết kế thành công vector biểu hiện 
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến. Sau đó, các 
vector tái tổ hợp này tiếp tục được kiểm tra và biến 
nạp vào các chủng vi khuẩn A. tumefaciens nhằm 
phục vụ cho công tác chuyển gen vào đậu tương. 
Hiện nay, sâu đục quả được biết tới là một trong 
những loại côn trùng gây hại ảnh hưởng nghiêm 
trọng tới các cây trồng quan trọng nói chung và cây 
đậu tương nói riêng. Để đối phó với tình hình sâu hại 
này, cho đến nay đã có nhiều các công trình nghiên 
cứu cho thấy các gen được phân lập từ các chủng vi 
khuẩn Bt có khả năng diệt được loại sâu tương đối đa 
dạng. Trong đó, một số nghiên cứu chỉ ra rằng, sự 
biểu hiện của gen cry1Ia trong cây bông chuyển gen 
đã giúp cho chúng có khả năng tiêu diệt một số loài 
sâu bọ cánh cứng đục quả và sâu keo mùa thu trên 
cây bông (de-Oliveira et al., 2016; Silva et al., 2016; 
Tounsi et al., 2003). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu 
đánh giá chức năng của độc tố do gen cry1Ia mã hóa 
trên đối tượng sâu đục quả ở cây đậu tương. Do vậy, 
trong nghiên cứu này đã tiến hành cải biến gen 
cry1Ia từ dạng dại ban đầu được phân lập từ chủng 
Bt TH19 ở Việt Nam và thiết kế thành công các 
vector biểu hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải 
biến. Với việc thiết kế thành công vector biểu hiện 
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến này, hy vọng 
rằng có thể sử dụng các cấu trúc véc tơ này để tạo 
các giống đậu tương chuyển gen không chỉ được 
tăng cường khả năng tiêu diệt sâu đục quả mà còn cả 
với các đối tượng sâu hại khác. 
4. KẾT LUẬN 
Các kết quả trong nghiên cứu cho thấy, gen 
cry1Ia dạng dại đã được cải biến bằng việc chỉnh sửa 
các bộ ba mã hóa của các axit amin nhưng không 
làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein 
Cry1Ia dạng dại ban đầu. Các cấu trúc vector biểu 
hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến đã được 
thiết kế thành công sẽ thích hợp cho biến nạp gen 
vào cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng diệt 
sâu đục quả. 
LỜI CẢM ƠN 
Công trình nghiên cứu được thực hiện trong 
khuôn khổ đề tài “Phân lập thiết kế gen kháng sâu 
tạo giống đậu tương biến đổi gen” theo Quyết định 
số 4495/QĐ-BNN-KHCN ngày 31/10/2016 của Bộ 
trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT về việc Phê duyệt 
danh mục các nhiệm vụ khoa học và công nghệ thực 
hiện từ năm 2017 thuộc Chương trình CNSH Nông 
nghiệp – Thủy sản. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Berg V. D., Shepard B. M., Nasikin (1998). 
Response of soybean to attack by stemfly 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 39 
Melagagromyza sofiae in farmers’ fields in Indonesia. 
Journal of Applied Ecology, 35: 514-522. 
2. Crickmore N., Zeigler D. R., Schnepf E., van 
Rie J., Lereclus D., Baum J., Bravo A., Dean D. H. 
(2013). Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature. 
Available online:  
sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/. 
3. de-Oliveira R. S., Oliveira-Neto O. B., Moura 
H. F., de Macedo L. L., Arraes F. B., Lucena W. A., 
Lourenco-Tessutti I. T., de Deus Barbosa A. A., da 
Silva M. C., Grossi-de-Sa M. F. (2016). Transgenic 
Cotton Plants Expressing Cry1Ia12 Toxin Confer 
Resistance to Fall Armyworm (Spodoptera 
frugiperda) and Cotton Boll Weevil (Anthonomus 
grandis). Front Plant Sci, 7: 165. 
4. Erickson B (2008). Corn/soybean rotation 
literature summary. Purdue Univ West Lafayetter IN. 
5. FAOSTAT (2019). Food and agriculture 
organization of the United Nations (FAO) statistical 
databases, Available at:  
Retrieved 10 august 2019. 
6. Froger A. and Hall J. E (2007). 
Transformation of plasmid DNA into E. coli using the 
heat shock method. Journal of visualized 
experiments, JoVE(6): 253-253. 
7. Gain U (2018). Vietnam—oilseeds and 
products annual 2018, Global agricultural 
information network (Gain) report VM8018, USDA 
Gain, Hanoi, Vietnam. 
8. Hudson L., Bost K., Piller K. (2011). 
Optimizing Recombinant Protein Expression in 
Soybean, Soybean - Molecular Aspects of Breeding, 
Aleksandra Sudaric, IntechOpen, DOI: 
10.5772/15111. Available from: 
https://www.intechopen.com/books/soybean-
molecular-aspects-of-breeding/optimizing-
recombinant-protein-expression-in-soybean 
9. Kumar S., Chandra A., Pandey K. C. (2008). 
Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic crop: an 
environment friendly insectpest management 
strategy. J Environ Biol, 29(5):64-153. 
10. Morrison M. J., Cober E. R., Gregorich E. G., 
Voldeng H. D., Ma B., Topp G. C. (2017). Tillage and 
crop rotation effects on the yield of corn, soybean, 
and wheat in eastern Canada. Can. J. Plant Sci, 98: 
183-191. 
11. Mourtzinis S., Marburger D., Gaska J., Diallo 
T., Lauer J. G., Conley S. (2017). Corn, soybean, and 
wheat yield response to crop rotation, nitrogen rates, 
and foliar fungicide application. Crop Sci, 57: 983-992. 
12. Murray E. E., Lotzer J., Eberle M. (1989). 
Codon usage in plant genes. Nucleic Acids Res, 
17(2): 477-498. 
13. Silva C. R., Monnerat R., Lima L. M., Martins 
E. S., Melo Filho P. A., Pinheiro M. P., Santos R. C. 
(2016). Stable integration and expression of a cry1Ia 
gene conferring resistance to fall armyworm and boll 
weevil in cotton plants. Pest Manag Sci, 72(8): 1549-
1557. 
14. Tabata J., Yokosuka T., Hattori M., Ohashi 
M., Noguchi H., Sugie H. (2008). Sex attractant 
pheromone of the limabean pod borer, Etiella 
zinckenella (Treitschke) (Lepidoptera: Pyralidae), in 
Japan. Appl. Entomol. Zool, 43 (3): 351–358. 
15. Tounsi S., Zouari N., Jaoua S. (2003). Cloning 
and study of the expression of a novel cry1Ia-type 
gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. J 
Appl Microbiol, 95(1): 23-28. 
16. USDA (2012). Field Release of Aphelinus 
glycinis (Hymenoptera: Aphelinidae) for Biological 
Control of the Soybean Aphid, Aphis glycines 
(Hemiptera: Aphididae), in the Continental United 
States. Environmental Assessment. 
17. Zhang L., Guo Y., Luo L., Wang Y. P., Dong 
Z. M., Sun S. H., Qiu L. J. (2011). Analysis of Nuclear 
Gene Codon Bias on Soybean Genome and 
Transcriptome. Acta Agronomica Sinica, 37(6): 965-
974. 
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 
N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 40 
MODIFICATION AND CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTOR CARRYING cry1Ia 
GENES CONFERRING RESISTANCE TO SOYBEAN POD BORER Etiella zinkenella 
Nguyen Huu Kien1, Nguyen Thi Hoa1, Le Thi Mai Huong1, 
Nguyen Trung Anh1, Nguyen Tuan Minh1, Dinh Thi Mai Thu1, 
Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, Nguyen Nhat Linh1, 
Nguyen Anh Vu1, Le Thi Thu Hien2, Nguyen Van Dong1* 
1Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences 
2Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology 
Email: dongjircas@yahoo.com 
Summary 
Soybean (Glycine max L.) is one of the most economically important crops. However, the yield and quality 
of soybean are seriously affected by the infestation of pod borer Etiella zinkenella Treitschke. Recently, 
numerous studies have evaluated effects of Cry toxin on pod borer Etiella zinkenella on different crops but 
studying on soybean is still limited. In this study, we modified the cry1Ia gene and constructed the 
expression vectors carrying the wild- and modified-cry1Ia genes from the isolated Bacillus thuringiensis 
strain TH19 in Vietnam. Our present study provides materials for transforming the wild- and modified-
cry1Ia genes into soybean to increase resistance to pod borer Etiella zinkenella. 
Keywords: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, Etiella zinkenella, pZY101-Asc vector, soybean. 
Người phản biện: PGS.TS. Hà Viết Cường 
Ngày nhận bài: 19/5/2020 
Ngày thông qua phản biện: 19/6/2020 
Ngày duyệt đăng: 26/6/2020