Bài giảng Quang học kỹ thuật và ứng dụng - Chương 2: Phương pháp phổ tử ngoại và khả kiến - Phạm Thị Hải Miền

CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP PHỔ TỬ NGOẠI VÀ KHẢ KIẾN
1. Cơ sở lý thuyết
2. Kỹ thuật thực nghiệm
3. Ứng dụng của phổ UV-VIS trong y sinh học
1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Electron trong phân tử
Electron lớp trong:
không tạo liên kết
Electron lớp ngoài (hoá trị)
Tạo liên kết Không tạo liên kết
σ π n
43
1
2
σ*
σ
π*
π
n
Sơ đồ cácmức năng lượng
và các bước chuyển năng lượng trong phổđiện tử
σ σ* - tử ngoại xa
π π*, n π* - tử ngoại gần, khả kiến
n σ* - tử ngoại
2. KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
Cấu tạo máy quang phổ hấp thụ UV-VIS
Nguồn sáng:
- Đèn Deuterium hay đèn Hydro: 200–380 nm 
- Đèn Tungsten (vonfram): 350 – 2500 nm 
Bộ đơn sắc: 
- Kính lọc
- Lăng kính
- Cách tử 1200 vạch/mm 
Cuvet đựng mẫu: 
- Đo vùng tử ngoại: dùng Cuvet thạch anh
- Đo vùng khả kiến: dùng Cuvet thạch anh, thủy tinh, nhựa
Detector: Bộ phận chủ yếu là tế bào quang điện
Sơ đồ nguyên lý máy quang phổ hấp thụ UV-VIS hai chùm tia
Kỹ thuật định lượng bằng phổ UV-VIS:
a. Chọn bước sóng: chọn bước sóng ứng với cực đại hấp
thụ lớn nhất. Tại max, sai số bước sóng ít ảnh hưởng.
b. Chọn khoảng nồng độ thích hợp: khoảng nồng độ
trong đó quan hệ giữa A và C là tuyến tính.
c. Chọn dung môi:
- Dung môi không được hấp thụ ở vùng phổ cần đo.
Người ta thường dùng các loại dung môi như:
methanol, ethanol, hoặc các loại dung môi không màu
như chloroform, dioxane, benzen
- Dung môi không lẫn tạp chất.
- Dung môi không phân cực tốt hơn dung môi phân cực.
4. ỨNG DỤNG CỦA PHỔ UV-VIS 
TRONG Y SINH HỌC
Máy quang phổ UV - VIS được sử dụng rộng rãi
trong ngành công nghiệp hóa học, sinh học, công nghệ
thực phẩm, đồ uống cũng như môi trường.
 Phân tích các hoá chất vô cơ hay hữu cơ.
 Phân tích sự an toàn của thực phẩm.
 Phân tích máu huyết.
 Phân tích DNA/RNA, protein.
 Phân tích dược phẩm, nông dược.
 Phân tích lượng chlorine trong nước sinh hoạt.
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HUỲNH QUANG 
TRONG CHẨN ĐOÁN 
CÁC BỆNH LÝ KHOANG MIỆNG
TỔNG QUAN
Các bệnh lý về miệng thường rất nguy hiểm do không chẩn đoán
sớm.
Bạch sản ở bờ lưỡi (A); Biểu mô này do hiện 
tượng tăng gai và tăng sừng (B) 
Viêm tăng sản nướu
Ung thư
Thiết bị Indentafi 3000 (R) Ultra Thiết bị Velscope
Những thiết bị sử dụng tính chất phát huỳnh quang của mô miệng để
phát hiện bệnh lý bằng mắt thường và bằng phương pháp ảnh huỳnh
quang.
CẤU TẠO NIÊM MẠC MIỆNG
Niêm mạc: lót ẩm của đường tiêu
hóa, đường mũi và khoang khác
trong cơ thể tiếp xúc với bên ngoài. 
Trong khoang miệng màng được gọi
là màng nhầy miệng hoặc niêm mạc
miệng. 
Chức năng của niêm mạc miệng
 Bảo vệ
 Cảm giác
 Tiết ra
 Điều chỉnh nhiệt độ
Một số Fluorophore chính trong niêm mạc miệng
Fluorophores
Bước sóng
kích thích
(nm)
Bước sóng
phát quang
(nm)
NADH 360 450
FAD 450 530
Keratin và các tế bào
sừng
350-400 430
Porphyrin 490 630
Collagen và elastin 
crosslinks 
(Pentosidine)
335 380
(1) Đầu đèn gắn LED công suất
(2) Thân đèn
(3) Đuôi đèn
(4) Kính lọc UV bandpass UG-1
(5) LED công suất
(6) Pin 4,5V
Đèn PIN huỳnh quang
Khoang miệng khỏe mạnh
Ảnh chụp bờ lưỡi chiếu bởi ánh sáng thường (A) và đèn PIN 380nm (B)
Lưỡi bệnh nhân bị bạch sản (leukoplakia) dưới ánh sáng thường (A); ảnh 
huỳnh quang bước sóng kích thích 380nm sử dụng thiết bị Multispectral 
Digital Microscope
Ảnh chụp lưỡi chiếu bởi ánh sáng thường (A) và đèn PIN380nm (B)
Ung thư biểu mô tế bào vảy bụng lưỡi bên trái dưới ánh sáng
thường(A); ảnh huỳnh quang sử dụng thiết bị Indentafi (R) 3000 Ultra
Lưỡi bình thường và lưỡi được kích thích 
bởi đèn PIN
Lưỡi được chụp bằng 
thiết bị Velscope 
=> Trên lưỡi xuất hiện màu cam đỏ, màu này do các vi khuẩn pophyrin 
phát ra , những dấu chấm đen nhỏ, đó chính là các nhú dạng gai
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HUỲNH QUANG 
TRONG CHẨN ĐOÁN 
CÁC BỆNH DA LIỄU
CẤU TRÚC SINH HỌC MÔ DA
Các bệnh về da thường tập
trung ở lớp biểu bì
TÍNH CHẤT PHÁT QUANG CỦA DA
Thành phần hấp thụ của mô da Thành phần phát quang của mô da
Thành phần hấp thụ của mô da Thành phần phát quang của mô da
TÍNH CHẤT QUANG HỌC CỦA DA
 Thành phần hấp thụ chủ yếu trong lớp biểu bì là melanin.
 Lớp hạ bì hấp thụ chủ yếu trong phạm vi quang phổ nhìn thấy 
được do hemoglobin trong máu, carotene và bilirubin. 
 Sự hấp thu của hemoglobin và nước của lớp hạ bì và chất béo của 
lớp biểu bì da xác định các tính chất hấp thu của toàn bộ da
 Bằng chứng thực nghiệm cho thấy tổn thương da bất thường có 
đặc tính quang học khác với da thường.
A: Chụp thường
B: Phóng đại 10x
C: Phóng đại 50x
1. Ánh sáng thường
1. Ánh sáng thường
2. Kích thích 380 nm
A: Chụp thường
B: Phóng đại 10x
C: Phóng đại 50x
Propionibacterium Acnes là nguyên nhân gây ra huỳnh quang màu đỏ ở những 
bệnh nhân bị mụn. 
A: Ánh sáng thường
B: Bước sóng 365nm
Vùng chữ UVùng chữ T
 3
HUỲNH QUANG DA VẨY NẾN
Vảy nến ở đầu Vẩy nến ở cổ tay
Da đầu bị nấm Da mụn
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HUỲNH QUANG 
TRONG PHÁT HIỆN
BỆNH SÂU RĂNG
DENTAL CARIES
30
CAUSES
STAGES
DETECTION OF DENTAL CARIES
31
Visual-tactile examination X-ray 
Caries detection methods should be capable of detecting lesions at an early stage,
when progression can be arrested or reserved, avoiding premature tooth
treatment by restorations. However, none of the above mentioned methods
fulfill this requirement.
FLUORESCENCE CAMERA
32
 Violet LED light stimulates 
porphyrins, special metabolites of 
cariogenic bacteria, to emit red light. 
 Sound enamel gives off green light.
 Reliable recognition and visualisation
of plaque and early enamel caries.
 Diagnostics, communication, 
therapeutic care and documentation.
 Safety (non-ionizing radiation).
 Quick time test.
FLUORESCENCE IMAGES
33
Sound tooth:
A – white light
B – UVA light
Dental plaque: 
A - white light B - UVA light 
C - white light, magnified 10x
D - UVA light, magnified 10x
Dental caries:
A - white light B - UVA light 
C - white light, magnified 10x
D - UVA light, magnified 10x
FLUORESCENCE IMAGES
34
Hidden caries:
A - white light
B - white light after grinding
C - white light, magnified 10x
D - UVA light, magnified 10x
 Hidden caries is a carious lesion
seen in dentine on a bitewing
radiograph where clinically the
enamel appears sound or only
minimally demineralized (Figure
A-C).
 Under UVA stimulation, a small
red spot appeared (Figure D).
 To confirm the presence of a
hidden caries, this area was ground
from the surface to the dentin layer
until the cavity appeared (Figure B)
 This is dentin caries at the
depth of 1-2 mm.
FLUORESCENCE SPECTRA
35
Sound teeth
Caries teeth
 Sound teeth emit blue – green light on the white background.
Caries teeth emit red light.
36
DESIGN OF FLUORESCENCE CAMERA
Components:
 380-nm LED with UV filter
 White LED
 Camera with 480-nm filter
 Electronic circuit
 Power supply: USB 2.0 (5V), battery 9V
 Transmission path: USB 2.0, via cable
 Handpiece weight: ~ 50 g (without
battery and cable)
 Handpiece length: ~ 25 cm